本文關(guān)鍵詞：子癇前期中非編碼RNA對滋養(yǎng)細胞功能的調(diào)控及機制探索，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：子癇前期(Preeclampsia,PE)為妊娠期高血壓疾病的一種,以妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等為主要臨床表現(xiàn)的妊娠特發(fā)疾病,甚至可致全身多臟器損傷,嚴重影響母嬰健康,是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的重要原因。該病發(fā)病率居高不下,至今發(fā)病機制不明,病因?qū)W說眾多,主要有子宮螺旋小動脈重鑄不足(俗稱“胎盤淺著床”)、炎癥免疫過度激活、血管內(nèi)皮細胞受損(包括炎癥介質(zhì)、氧化應(yīng)激等)、遺傳因素及營養(yǎng)缺乏、胰島素抵抗等。其中子宮螺旋小動脈重鑄障礙與血管內(nèi)皮細胞受損在一定程度上與妊娠期絨毛外滋養(yǎng)細胞(Extravillous Trophoblast,EVT)行為改變密切相關(guān)。繼續(xù)深入探索影響EVT生物學(xué)功能的多方面因素并闡明其相關(guān)調(diào)節(jié)機理,進一步解讀PE發(fā)病機制將為PE防治提供新的靶標。近年來大量研究報道非編碼RNA(noncoding RNA,nc RNA)通過多種調(diào)控機制影響細胞功能,進而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展,甚至有科學(xué)家預(yù)言在生物發(fā)育的過程中,nc RNA起著不亞于蛋白質(zhì)的重要作用。故而本研究分別探討了nc RNAs家族中的兩個重要成員——微小RNA(micro RNA,mi RNA)和長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)在子癇前期發(fā)病中對滋養(yǎng)細胞功能的調(diào)控,并分別從氧化應(yīng)激與螺旋動脈重鑄兩個方面初步探索其相關(guān)機制:1.PE胎盤組織中表達異常的mi R-101靶向調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44(Endoplasmic Reticulum Protein 44,ERp44),進而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞過度凋亡反應(yīng),參與PE發(fā)病;2.PE胎盤組織中差異表達的lnc RNA MVIH通過誘導(dǎo)Jun B蛋白表達調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞增殖、遷移、侵襲能力及滋養(yǎng)細胞和血管內(nèi)皮細胞管型形成能力參與PE螺旋動脈重鑄過程。第一部分Mi R-101通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44調(diào)節(jié)子癇前期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞凋亡目的:1.比較人類PE與正常胎盤組織中mi R-101表達水平差異,結(jié)合課題組前期工作基礎(chǔ),分析mi R-101與ERp44表達量之間的相關(guān)性及二者之間是否存在靶向結(jié)合。2.探討mi R-101與ERp44結(jié)合是否對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞凋亡起重要調(diào)節(jié)作用。方法:1.選擇2011年12月至2012年3月在我南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行剖宮產(chǎn)分娩的60例產(chǎn)婦的胎盤絨毛組織,其中正常對照組和PE組各30例。采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction,q PCR)檢測30例PE及30例正常產(chǎn)婦胎盤組織中mi R-101的表達水平,結(jié)合課題組前期檢測此批30例胎盤組織中ERp44蛋白表達量,計算Person相關(guān)系數(shù)以分析mi R-101與ERp44蛋白表達水平之間的相關(guān)性,并采用熒光素酶報告基因試驗驗證二者靶向結(jié)合關(guān)系。2.為進一步驗證二者靶向關(guān)系,在人類EVT HTR-8/SVneo中分別過表達和敲低mi R-101表達后,首先采用q PCR驗證過表達、敲低效率,之后采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)法檢測ERp44蛋白的表達改變;3.為分析mi R-101對胎盤功能細胞——EVT的生物學(xué)行為(凋亡)的影響,在HTR-8/SVneo細胞中分別過表達和封閉mi R-101后,借助流式細胞技術(shù)及Hoechst染色法分析滋養(yǎng)細胞的凋亡數(shù)量改變,及Western blotting法檢測凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2的表達情況。4.在HTR-8/SVneo細胞中分別過表達和封閉mi R-101表達后,用Western blotting法評估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路激活情況,即檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF-6)、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、磷酸化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1(IRE1p)、活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF-4)等蛋白表達水平。5.為進一步驗證敲低mi R-101后對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活程度,同時給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA(4-Phenylbutyric acid,4-苯基丁酸)處理細胞后,Western blotting法再次檢測上述蛋白表達情況。結(jié)果:1.(1)納入研究的30例PE及30例正常產(chǎn)婦一般臨床資料比較:兩組產(chǎn)婦的年齡、孕周、是否吸煙等指標均無顯著性差異(p㧐0.05),收縮壓、舒張壓、蛋白尿及胎兒出生體重均具有統(tǒng)計學(xué)差異(p㩳0.05或0.01)。(2)PE胎盤組織中mi R-101表達下調(diào),低于正常妊娠組60%(P㩳0.05);Person相關(guān)性分析表明mi R-101與ERp44蛋白表達量之間呈顯著負相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)=-0.826,P㩳0.01);熒光素酶報告基因試驗證實mi R-101可以結(jié)合到野生型ERp44的3’UTR區(qū),熒光抑制率達30%(p㩳0.01),二者存在一定的靶向結(jié)合關(guān)系。2.HTR-8/SVneo中過表達mi R-101后,mi R-101表達水平較對照組升高28倍,干擾序列致mi R-101表達下調(diào)45%,證明轉(zhuǎn)染成功;過表達mi R-101后ERp44表達下調(diào)約50%(P㩳0.01);封閉mi R-101表達后,ERp44表達升高2.39倍(P㩳0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3.HTR-8/SVneo中過表達mi R-101后滋養(yǎng)細胞凋亡數(shù)量減少,凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3、抑凋亡蛋白Bcl-2表達亦受到相應(yīng)調(diào)節(jié);封閉mi R-101表達后凋亡反應(yīng)加劇,與過表達效果相反。4.HTR-8/SVneo中過表達mi R-101后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路被抑制,Caspase-12、ATF-6、PERK、CHOP、IRE1p、ATF-4等蛋白表達量顯著增加;封閉mi R-101表達后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路被激活,Caspase-12、ATF-6、PERK、CHOP、IRE1p、ATF-4等蛋白表達量明顯減少。5.封閉mi R-101表達能部分逆轉(zhuǎn)4-PBA對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的抑制作用。結(jié)論:PE中mi R-101通過靶向調(diào)節(jié)ERp44參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞凋亡過程。第二部分長鏈非編碼RNA MVIH誘導(dǎo)Jun B蛋白表達調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞增殖、遷移、侵襲及內(nèi)皮細胞管型形成能力參與子癇前期螺旋動脈重鑄過程目的:1.比較分析人類PE與正常胎盤組織中l(wèi)nc RNA MVIH表達水平差異,探討其與PE發(fā)病是否相關(guān)。2.探討MVIH對滋養(yǎng)細胞及血管內(nèi)皮細胞功能(增殖、遷移和侵襲、管型形成)的調(diào)控,分析其是否能夠發(fā)揮對PE螺旋動脈重鑄過程的調(diào)控。3.分析MVIH調(diào)節(jié)上述過程的可能機制。方法:1.選擇2011年12月至2012年3月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行剖宮產(chǎn)分娩的60例產(chǎn)婦的胎盤絨毛組織,其中正常對照組和PE組各30例。采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(q PCR)檢測30例PE及30例正常產(chǎn)婦胎盤組織中MVIH的表達水平。2.為分析MVIH對胎盤功能細胞—滋養(yǎng)細胞的生物學(xué)行為的影響,在兩滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo及JEG-3細胞中分別過表達和封閉MVIH后,首先q PCR實驗檢測過表達及封閉效率。3.HTR-8/SVneo及JEG-3細胞中分別過表達和封閉MVIH后,采用MTT法檢測滋養(yǎng)細胞的活力,及流式細胞儀分析各細胞周期所占比例的改變以探討其對細胞增值潛力的調(diào)控。4.為檢測MVIH對滋養(yǎng)細胞遷移、侵襲功能的影響,采用Transwell(不鋪膠)實驗在HTR-8/SVneo細胞中分別過表達和封閉MVIH,另采用Transwell(鋪膠)實驗在JEG-3細胞中分別過表達和封閉MVIH后,探討滋養(yǎng)細胞遷移、侵襲能力受MVIH調(diào)節(jié)情況。5.在HTR-8/SVneo及臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)兩細胞株中分別過表達和封閉MVIH后,用管型形成試劑盒評估其對兩細胞株管型形成能力的調(diào)節(jié)作用,并采用q PCR法分析兩組細胞中干預(yù)MVIH表達后血管形成相關(guān)因子—血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體(s Flt-1)、血管生成素I和II(Ang I,Ang II)的表達改變情況,進一步證實MVIH對滋養(yǎng)細胞及內(nèi)皮細胞血管形成的影響。6.為探索MVIH對滋養(yǎng)細胞及內(nèi)皮細胞功能調(diào)控的潛在機制,在HTR-8/SVneo細胞中分別過表達和封閉MVIH后,采用蛋白質(zhì)譜(i TRAQ)檢測并分析、篩選受MVIH調(diào)控蛋白的表達情況。7.對篩選目的蛋白進行過表達干預(yù),觀察HTR-8/SVneo細胞增殖、遷移功能改變情況,及HUVEC細胞管型形成能力功能改變情況;與si-MVIH協(xié)同處理細胞,進行補救實驗,進一步驗證目的蛋白直接受MVIH調(diào)節(jié)從而影響細胞上述功能。結(jié)果:1.(1)納入研究的30例PE及30例正常產(chǎn)婦一般臨床資料比較:兩組產(chǎn)婦的年齡、孕周、是否吸煙等指標均無顯著性差異(p㧐0.05),收縮壓、舒張壓、蛋白尿及胎兒出生體重均具有統(tǒng)計學(xué)差異(p㩳0.05或0.01);(2)與正常妊娠組相比,PE胎盤組織中MVIH表達下調(diào)超過70%(P㩳0.01),表達差異顯著。2.HTR-8/SVneo中轉(zhuǎn)染MVIH過表達質(zhì)粒(pIRES2-MVIH)后,MVIH表達水平較對照組升高39.31倍,干擾序列封閉MVIH表達達72%;JEG-3細胞中過表達MVIH后,MVIH表達水平較對照組升高21.05倍,封閉MVIH后其表達下降達63%,證明轉(zhuǎn)染成功。3.HTR-8/SVneo及JEG-3細胞中過表達MVIH后兩細胞活力提高,細胞有絲分裂周期加快,促進細胞由G1期向S期或G2期進展;封閉MVIH表達后兩細胞活力下降,G1期細胞數(shù)量增加,S期或G2期細胞比例減少,細胞有絲分裂進程均受到不同程度抑制。4.HTR-8/SVneo細胞中過表達MVIH后,穿膜細胞數(shù)量增加,遷移能力提高,干擾MVIH表達后結(jié)果相反;而在JEG-3細胞中過表達MVIH后,侵襲細胞數(shù)量增加,細胞侵襲能力提高,封閉MVIH表達后結(jié)果相反。5.血管形成實驗表明,HTR-8/SVneo及HUVEC細胞中過表達MVIH后,細胞形成管型分支節(jié)點數(shù)與分支長度均增加;同時,q PCR結(jié)果證實,兩細胞中過表達MIVH組血管形成相關(guān)因子VEGF、Ang I、Ang II表達均上調(diào),抑制血管生成因子s Flt-1表達下調(diào);而干擾MVIH表達后結(jié)果相反。6.蛋白質(zhì)譜實驗結(jié)果經(jīng)過篩選后發(fā)現(xiàn),Jun B蛋白在過表達MVIH組比對照組表達上調(diào),同時其在封閉MVIH組表達下調(diào),由此證明Jun B蛋白表達直接受MVIH調(diào)節(jié)。7.(1)HTR-8/SVneo細胞中過表達Jun B后,相對于對照組,細胞增殖、遷移能力均提高;而在與si-MVIH共轉(zhuǎn)染細胞后,上述促進作用部分被抑制。(2)HUVEC細胞中過表達Jun B后,相對于對照組,管型形成能力增強;而在與si-MVIH共轉(zhuǎn)染細胞后,上述促進作用部分被抑制。說明MVIH通過誘導(dǎo)Jun B表達促進滋養(yǎng)細胞增殖、遷移能力及血管內(nèi)皮細胞管型形成能力,從而發(fā)揮對螺旋動脈重鑄過程的調(diào)節(jié)作用。結(jié)論:PE中MVIH通過誘導(dǎo)Jun B蛋白發(fā)揮對滋養(yǎng)細胞增殖、遷移、侵襲及血管形成能力的調(diào)節(jié)作用,從而參與PE螺旋動脈重鑄過程。
【關(guān)鍵詞】：子癇前期(PE) mi R-101 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44(ERp44) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡 子癇前期(PE) 長鏈非編碼RNA(lnc RNA) MVIH Jun B蛋白 增殖 遷移和侵襲 血管形成
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.244
【目錄】：

• 英文縮寫表4-8
• 摘要8-15
• Abstract15-24
• 前言24-32
• 參考文獻29-32
• 第一部分 Mi R-101通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44調(diào)節(jié)子癇前期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞凋亡32-71
• 引言32-35
• 材料與方法35-51
• 結(jié)果51-63
• 討論63-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻67-71
• 第二部分 長鏈非編碼RNA MVIH通過誘導(dǎo)Jun B蛋白促進滋養(yǎng)細胞增殖、遷移、侵襲及內(nèi)皮細胞管型形成功能參與子癇前期螺旋動脈重鑄過程71-122
• 引言71-74
• 材料與方法74-94
• 結(jié)果94-113
• 討論113-117
• 結(jié)論117-118
• 參考文獻118-122
• 全文總結(jié)122-123
• 綜述一 子癇前期發(fā)病機制相關(guān)研究進展123-137
• 參考文獻131-137
• 綜述二 子癇前期發(fā)病中長鏈非編碼RNA與氧化應(yīng)激的關(guān)系綜述137-148
• 參考文獻143-148
• 學(xué)習(xí)期間論文發(fā)表情況148-150
• 致謝150-151

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周海慧;硬膜外阻滯用于分娩鎮(zhèn)痛療效分析[J];海南醫(yī)學(xué);2004年10期

2 劉s，

本文編號：255614