本文關(guān)鍵詞：子癇前期中非編碼RNA對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控及機(jī)制探索，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：子癇前期(Preeclampsia,PE)為妊娠期高血壓疾病的一種,以妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等為主要臨床表現(xiàn)的妊娠特發(fā)疾病,甚至可致全身多臟器損傷,嚴(yán)重影響母嬰健康,是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的重要原因。該病發(fā)病率居高不下,至今發(fā)病機(jī)制不明,病因?qū)W說(shuō)眾多,主要有子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄不足(俗稱“胎盤淺著床”)、炎癥免疫過(guò)度激活、血管內(nèi)皮細(xì)胞受損(包括炎癥介質(zhì)、氧化應(yīng)激等)、遺傳因素及營(yíng)養(yǎng)缺乏、胰島素抵抗等。其中子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄障礙與血管內(nèi)皮細(xì)胞受損在一定程度上與妊娠期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(Extravillous Trophoblast,EVT)行為改變密切相關(guān)。繼續(xù)深入探索影響EVT生物學(xué)功能的多方面因素并闡明其相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)理,進(jìn)一步解讀PE發(fā)病機(jī)制將為PE防治提供新的靶標(biāo)。近年來(lái)大量研究報(bào)道非編碼RNA(noncoding RNA,nc RNA)通過(guò)多種調(diào)控機(jī)制影響細(xì)胞功能,進(jìn)而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展,甚至有科學(xué)家預(yù)言在生物發(fā)育的過(guò)程中,nc RNA起著不亞于蛋白質(zhì)的重要作用。故而本研究分別探討了nc RNAs家族中的兩個(gè)重要成員——微小RNA(micro RNA,mi RNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)在子癇前期發(fā)病中對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控,并分別從氧化應(yīng)激與螺旋動(dòng)脈重鑄兩個(gè)方面初步探索其相關(guān)機(jī)制:1.PE胎盤組織中表達(dá)異常的mi R-101靶向調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44(Endoplasmic Reticulum Protein 44,ERp44),進(jìn)而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度凋亡反應(yīng),參與PE發(fā)病;2.PE胎盤組織中差異表達(dá)的lnc RNA MVIH通過(guò)誘導(dǎo)Jun B蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞管型形成能力參與PE螺旋動(dòng)脈重鑄過(guò)程。第一部分Mi R-101通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44調(diào)節(jié)子癇前期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡目的:1.比較人類PE與正常胎盤組織中mi R-101表達(dá)水平差異,結(jié)合課題組前期工作基礎(chǔ),分析mi R-101與ERp44表達(dá)量之間的相關(guān)性及二者之間是否存在靶向結(jié)合。2.探討mi R-101與ERp44結(jié)合是否對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡起重要調(diào)節(jié)作用。方法:1.選擇2011年12月至2012年3月在我南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行剖宮產(chǎn)分娩的60例產(chǎn)婦的胎盤絨毛組織,其中正常對(duì)照組和PE組各30例。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction,q PCR)檢測(cè)30例PE及30例正常產(chǎn)婦胎盤組織中mi R-101的表達(dá)水平,結(jié)合課題組前期檢測(cè)此批30例胎盤組織中ERp44蛋白表達(dá)量,計(jì)算Person相關(guān)系數(shù)以分析mi R-101與ERp44蛋白表達(dá)水平之間的相關(guān)性,并采用熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證二者靶向結(jié)合關(guān)系。2.為進(jìn)一步驗(yàn)證二者靶向關(guān)系,在人類EVT HTR-8/SVneo中分別過(guò)表達(dá)和敲低mi R-101表達(dá)后,首先采用q PCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)、敲低效率,之后采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)法檢測(cè)ERp44蛋白的表達(dá)改變;3.為分析mi R-101對(duì)胎盤功能細(xì)胞——EVT的生物學(xué)行為(凋亡)的影響,在HTR-8/SVneo細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和封閉mi R-101后,借助流式細(xì)胞技術(shù)及Hoechst染色法分析滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡數(shù)量改變,及Western blotting法檢測(cè)凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)情況。4.在HTR-8/SVneo細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和封閉mi R-101表達(dá)后,用Western blotting法評(píng)估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路激活情況,即檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF-6)、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、磷酸化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1(IRE1p)、活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF-4)等蛋白表達(dá)水平。5.為進(jìn)一步驗(yàn)證敲低mi R-101后對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活程度,同時(shí)給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA(4-Phenylbutyric acid,4-苯基丁酸)處理細(xì)胞后,Western blotting法再次檢測(cè)上述蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1.(1)納入研究的30例PE及30例正常產(chǎn)婦一般臨床資料比較:兩組產(chǎn)婦的年齡、孕周、是否吸煙等指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(p㧐0.05),收縮壓、舒張壓、蛋白尿及胎兒出生體重均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p㩳0.05或0.01)。(2)PE胎盤組織中mi R-101表達(dá)下調(diào),低于正常妊娠組60%(P㩳0.05);Person相關(guān)性分析表明mi R-101與ERp44蛋白表達(dá)量之間呈顯著負(fù)相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)=-0.826,P㩳0.01);熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)證實(shí)mi R-101可以結(jié)合到野生型ERp44的3’UTR區(qū),熒光抑制率達(dá)30%(p㩳0.01),二者存在一定的靶向結(jié)合關(guān)系。2.HTR-8/SVneo中過(guò)表達(dá)mi R-101后,mi R-101表達(dá)水平較對(duì)照組升高28倍,干擾序列致mi R-101表達(dá)下調(diào)45%,證明轉(zhuǎn)染成功;過(guò)表達(dá)mi R-101后ERp44表達(dá)下調(diào)約50%(P㩳0.01);封閉mi R-101表達(dá)后,ERp44表達(dá)升高2.39倍(P㩳0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.HTR-8/SVneo中過(guò)表達(dá)mi R-101后滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡數(shù)量減少,凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3、抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)亦受到相應(yīng)調(diào)節(jié);封閉mi R-101表達(dá)后凋亡反應(yīng)加劇,與過(guò)表達(dá)效果相反。4.HTR-8/SVneo中過(guò)表達(dá)mi R-101后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路被抑制,Caspase-12、ATF-6、PERK、CHOP、IRE1p、ATF-4等蛋白表達(dá)量顯著增加;封閉mi R-101表達(dá)后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路被激活,Caspase-12、ATF-6、PERK、CHOP、IRE1p、ATF-4等蛋白表達(dá)量明顯減少。5.封閉mi R-101表達(dá)能部分逆轉(zhuǎn)4-PBA對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的抑制作用。結(jié)論:PE中mi R-101通過(guò)靶向調(diào)節(jié)ERp44參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過(guò)程。第二部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA MVIH誘導(dǎo)Jun B蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及內(nèi)皮細(xì)胞管型形成能力參與子癇前期螺旋動(dòng)脈重鑄過(guò)程目的:1.比較分析人類PE與正常胎盤組織中l(wèi)nc RNA MVIH表達(dá)水平差異,探討其與PE發(fā)病是否相關(guān)。2.探討MVIH對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能(增殖、遷移和侵襲、管型形成)的調(diào)控,分析其是否能夠發(fā)揮對(duì)PE螺旋動(dòng)脈重鑄過(guò)程的調(diào)控。3.分析MVIH調(diào)節(jié)上述過(guò)程的可能機(jī)制。方法:1.選擇2011年12月至2012年3月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行剖宮產(chǎn)分娩的60例產(chǎn)婦的胎盤絨毛組織,其中正常對(duì)照組和PE組各30例。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(q PCR)檢測(cè)30例PE及30例正常產(chǎn)婦胎盤組織中MVIH的表達(dá)水平。2.為分析MVIH對(duì)胎盤功能細(xì)胞—滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響,在兩滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo及JEG-3細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和封閉MVIH后,首先q PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)及封閉效率。3.HTR-8/SVneo及JEG-3細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和封閉MVIH后,采用MTT法檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞的活力,及流式細(xì)胞儀分析各細(xì)胞周期所占比例的改變以探討其對(duì)細(xì)胞增值潛力的調(diào)控。4.為檢測(cè)MVIH對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲功能的影響,采用Transwell(不鋪膠)實(shí)驗(yàn)在HTR-8/SVneo細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和封閉MVIH,另采用Transwell(鋪膠)實(shí)驗(yàn)在JEG-3細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和封閉MVIH后,探討滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲能力受MVIH調(diào)節(jié)情況。5.在HTR-8/SVneo及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)兩細(xì)胞株中分別過(guò)表達(dá)和封閉MVIH后,用管型形成試劑盒評(píng)估其對(duì)兩細(xì)胞株管型形成能力的調(diào)節(jié)作用,并采用q PCR法分析兩組細(xì)胞中干預(yù)MVIH表達(dá)后血管形成相關(guān)因子—血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體(s Flt-1)、血管生成素I和II(Ang I,Ang II)的表達(dá)改變情況,進(jìn)一步證實(shí)MVIH對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響。6.為探索MVIH對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)控的潛在機(jī)制,在HTR-8/SVneo細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和封閉MVIH后,采用蛋白質(zhì)譜(i TRAQ)檢測(cè)并分析、篩選受MVIH調(diào)控蛋白的表達(dá)情況。7.對(duì)篩選目的蛋白進(jìn)行過(guò)表達(dá)干預(yù),觀察HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖、遷移功能改變情況,及HUVEC細(xì)胞管型形成能力功能改變情況;與si-MVIH協(xié)同處理細(xì)胞,進(jìn)行補(bǔ)救實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證目的蛋白直接受MVIH調(diào)節(jié)從而影響細(xì)胞上述功能。結(jié)果:1.(1)納入研究的30例PE及30例正常產(chǎn)婦一般臨床資料比較:兩組產(chǎn)婦的年齡、孕周、是否吸煙等指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(p㧐0.05),收縮壓、舒張壓、蛋白尿及胎兒出生體重均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p㩳0.05或0.01);(2)與正常妊娠組相比,PE胎盤組織中MVIH表達(dá)下調(diào)超過(guò)70%(P㩳0.01),表達(dá)差異顯著。2.HTR-8/SVneo中轉(zhuǎn)染MVIH過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pIRES2-MVIH)后,MVIH表達(dá)水平較對(duì)照組升高39.31倍,干擾序列封閉MVIH表達(dá)達(dá)72%;JEG-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MVIH后,MVIH表達(dá)水平較對(duì)照組升高21.05倍,封閉MVIH后其表達(dá)下降達(dá)63%,證明轉(zhuǎn)染成功。3.HTR-8/SVneo及JEG-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MVIH后兩細(xì)胞活力提高,細(xì)胞有絲分裂周期加快,促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期或G2期進(jìn)展;封閉MVIH表達(dá)后兩細(xì)胞活力下降,G1期細(xì)胞數(shù)量增加,S期或G2期細(xì)胞比例減少,細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程均受到不同程度抑制。4.HTR-8/SVneo細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MVIH后,穿膜細(xì)胞數(shù)量增加,遷移能力提高,干擾MVIH表達(dá)后結(jié)果相反;而在JEG-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MVIH后,侵襲細(xì)胞數(shù)量增加,細(xì)胞侵襲能力提高,封閉MVIH表達(dá)后結(jié)果相反。5.血管形成實(shí)驗(yàn)表明,HTR-8/SVneo及HUVEC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MVIH后,細(xì)胞形成管型分支節(jié)點(diǎn)數(shù)與分支長(zhǎng)度均增加;同時(shí),q PCR結(jié)果證實(shí),兩細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MIVH組血管形成相關(guān)因子VEGF、Ang I、Ang II表達(dá)均上調(diào),抑制血管生成因子s Flt-1表達(dá)下調(diào);而干擾MVIH表達(dá)后結(jié)果相反。6.蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)篩選后發(fā)現(xiàn),Jun B蛋白在過(guò)表達(dá)MVIH組比對(duì)照組表達(dá)上調(diào),同時(shí)其在封閉MVIH組表達(dá)下調(diào),由此證明Jun B蛋白表達(dá)直接受MVIH調(diào)節(jié)。7.(1)HTR-8/SVneo細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Jun B后,相對(duì)于對(duì)照組,細(xì)胞增殖、遷移能力均提高;而在與si-MVIH共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,上述促進(jìn)作用部分被抑制。(2)HUVEC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Jun B后,相對(duì)于對(duì)照組,管型形成能力增強(qiáng);而在與si-MVIH共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,上述促進(jìn)作用部分被抑制。說(shuō)明MVIH通過(guò)誘導(dǎo)Jun B表達(dá)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移能力及血管內(nèi)皮細(xì)胞管型形成能力,從而發(fā)揮對(duì)螺旋動(dòng)脈重鑄過(guò)程的調(diào)節(jié)作用。結(jié)論:PE中MVIH通過(guò)誘導(dǎo)Jun B蛋白發(fā)揮對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及血管形成能力的調(diào)節(jié)作用,從而參與PE螺旋動(dòng)脈重鑄過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：子癇前期(PE) mi R-101 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44(ERp44) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡 子癇前期(PE) 長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lnc RNA) MVIH Jun B蛋白 增殖 遷移和侵襲 血管形成
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.244
【目錄】：

• 英文縮寫表4-8
• 摘要8-15
• Abstract15-24
• 前言24-32
• 參考文獻(xiàn)29-32
• 第一部分 Mi R-101通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44調(diào)節(jié)子癇前期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡32-71
• 引言32-35
• 材料與方法35-51
• 結(jié)果51-63
• 討論63-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 第二部分 長(zhǎng)鏈非編碼RNA MVIH通過(guò)誘導(dǎo)Jun B蛋白促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及內(nèi)皮細(xì)胞管型形成功能參與子癇前期螺旋動(dòng)脈重鑄過(guò)程71-122
• 引言71-74
• 材料與方法74-94
• 結(jié)果94-113
• 討論113-117
• 結(jié)論117-118
• 參考文獻(xiàn)118-122
• 全文總結(jié)122-123
• 綜述一 子癇前期發(fā)病機(jī)制相關(guān)研究進(jìn)展123-137
• 參考文獻(xiàn)131-137
• 綜述二 子癇前期發(fā)病中長(zhǎng)鏈非編碼RNA與氧化應(yīng)激的關(guān)系綜述137-148
• 參考文獻(xiàn)143-148
• 學(xué)習(xí)期間論文發(fā)表情況148-150
• 致謝150-151

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周海慧;硬膜外阻滯用于分娩鎮(zhèn)痛療效分析[J];海南醫(yī)學(xué);2004年10期

2 劉s，

本文編號(hào)：255614