本文關(guān)鍵詞：SIRT3對(duì)小鼠心肌肥厚中線粒體脂質(zhì)代謝障礙及纖維化的影響及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景左室心肌肥厚(left ventricular hypertrophy, LVH)是心臟對(duì)于壓力或容量超負(fù)荷、肌節(jié)蛋白基因突變或心肌梗死導(dǎo)致收縮力下降等病理情況的適應(yīng)性反應(yīng),其伴隨著多種心臟疾病,如高血壓、瓣膜病及缺血性心臟病。在這些疾病的病理過程中,壓力負(fù)荷過重會(huì)導(dǎo)致向心性心肌肥厚,而向心性心肌肥厚被認(rèn)為是一種具有代償作用的病理改變因其可以增加左室收縮力、降低室壁壓力和心肌耗氧量。然而,左室心肌肥厚同樣可以成為嚴(yán)重心力衰竭以及惡性心律失常的危險(xiǎn)因素。因此,在不引起循環(huán)功能障礙的前提條件下有效的抑制左室心肌肥厚被認(rèn)為具有重要的臨床意義。在尋求抑制左室心肌肥厚方法的過程中,很重要的一點(diǎn)是明確心肌肥厚中不利于其適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制。在眾多心肌肥厚所帶來的不利因素中,能量代謝異常顯得尤為突出：在左室心肌肥厚的條件下,心臟的能量代謝方式由主要依靠長鏈脂肪酸有氧氧化轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟怯醒跹趸Ｄ芰看x底物的改變一方面可以減少生成每摩爾ATP所需的耗氧量,即能夠減少細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS)的生成；但另一方面,這一改變不可避免的存在著大量的不利因素,如慢性脂肪酸有氧氧化障礙導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積、乳酸堆積、以及糖酵解增多所帶來的總ATP水平下降。Van等在于2004年提出心肌代謝重構(gòu)(metabolic remodeling)的概念,即由心肌細(xì)胞在慢性超負(fù)荷及底物供應(yīng)改變時(shí)引起的心臟能量代謝途經(jīng)改變、線粒體功能失調(diào)以及高能磷酸鹽代謝異常致使心肌能量產(chǎn)生障礙、導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能異常的現(xiàn)象。但是目前關(guān)于左室心肌肥厚過程中脂質(zhì)代謝障礙的分子學(xué)機(jī)制尚未清楚。Sirtuins(SIRTs)是一類依賴NAD+輔酶的去乙酰化酶,包含7個(gè)不同的亞型。由Shore等于1984年首次在酵母菌中發(fā)現(xiàn),隨后SIRTs被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)酵母菌的壽限,2000年Imai等發(fā)現(xiàn)其具有依賴NAD+輔酶的去乙酰化活性并且可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝狀態(tài)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)SIRTs延長壽限的作用機(jī)制與熱量攝入限制(calorie restriction, CR)類似,提示其對(duì)細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)作用可能在這一過程種發(fā)揮重要作用。由于SIRTs的活性依賴于細(xì)胞內(nèi)NAD+輔酶的水平,且細(xì)胞內(nèi)NAD+輔酶的水平主要由細(xì)胞內(nèi)能量代謝狀態(tài)決定,因此,SIRTs對(duì)于細(xì)胞內(nèi)感知能量代謝的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要的調(diào)節(jié)作用。最近許多研究發(fā)現(xiàn),SIRTs調(diào)控許多關(guān)鍵細(xì)胞進(jìn)程,如胰島素分泌、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡。目前已經(jīng)有研究證明SIRTs是治療代謝紊亂及代謝相關(guān)疾病的藥物治療靶點(diǎn)。在已發(fā)現(xiàn)的七個(gè)SIRT蛋白中,SIRT3是唯一一個(gè)被證明其表達(dá)水平與人類壽命長度相關(guān)的分子。目前,已有研究表明SIRT3具有易化脂類、氨基酸及碳水化合物代謝的作用。且許多研究發(fā)現(xiàn)SIRT3可以通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。SIRT3可以去乙酰化多種線粒體內(nèi)代謝關(guān)鍵酶,如乙酰輔酶A合成酶2 (acetyl-CoA-synthetase 2, AceCS2)長鏈脂酰輔酶A脫氫酶(Long-chain acyl CoA dehydrogenase, LCAD),琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase),異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase),并使這些代謝酶活性升高。其中,LCAD是一個(gè)脂肪酸有氧氧化過程中的關(guān)鍵酶,但是目前關(guān)于SIRT3是否能通過影響LCAD活性從而發(fā)揮降低心肌肥厚脂質(zhì)累積的作用尚不清楚。研究目的：1.探討SIRT3在心肌肥厚中是否具有保護(hù)作用。2.探討SIRT3對(duì)心肌肥厚中線粒體脂質(zhì)代謝的影響。3.研究過表達(dá)SIRT3是否能夠減輕肥厚心肌細(xì)胞中脂質(zhì)累積。研究方法：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合國家衛(wèi)生部動(dòng)物管理辦法(文案號(hào)No.55,2001)和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。SIRT3-KO小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室,6-7周齡雄性129野生型小鼠購自北京大學(xué)動(dòng)物研究所。2.構(gòu)建小鼠心肌肥厚模型：我們給予8周齡雄性小鼠(年齡匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠)以胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)(TAC)。我們采用戊巴比妥鈉對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉,將胸主動(dòng)脈從周圍組織中分離出來,于兩側(cè)頸總動(dòng)脈之間放置27號(hào)空針針頭(27-gauge needle)然后進(jìn)行手術(shù)縫線結(jié)扎,迅速將針頭移除。除結(jié)扎外,假手術(shù)組動(dòng)物被給予相同處理。所有動(dòng)物在術(shù)后6周處死,將小鼠心臟取材進(jìn)行肥厚指標(biāo)和脂質(zhì)分析等方面的研究。3.免疫組織化學(xué)：取材后,組織切片進(jìn)行HE染色觀察形態(tài),進(jìn)行Masson染色來評(píng)估膠原含量。膠原含量采用自動(dòng)圖像分析軟件(Image Pro Plus)進(jìn)行定量分析。4.超聲心動(dòng)圖：采用VisualSonics Vevo 770小動(dòng)物超聲進(jìn)行左室長軸測(cè)量,分別采用M-mode、二維超聲心動(dòng)圖(2-D)、脈沖多普勒超聲(Pulse Wave Doppler, PWD)等模式進(jìn)行圖形采集并分析。5.透射電子顯微分析：利用透射電子顯微鏡(TEM, H-7000FA, Hitachi, Tokyo, Japan)對(duì)心肌組織超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析,放大倍數(shù)為15000倍。6.甘油三酯和膽固醇含量分析：心肌組織中的甘油三酯(TG)和膽固醇(cholesterol)采用氯仿、甲醇混合液提取,然后分別采用定量試劑盒進(jìn)行分析(Biovision Inc)7.離體Langendorff灌流和棕櫚酸酯氧化率測(cè)定：離體心臟在37℃溫箱中進(jìn)行Langendorff體外灌流(95% 02,5%C02),灌流壓力設(shè)置為1OOmmHg。經(jīng)過15分鐘的穩(wěn)定期,灌流液置換為含1mM3H標(biāo)記的棕櫚酰酯的緩沖液,放射量為0.2μCi ml-1,灌流持續(xù)1小時(shí)。通過在上清液中檢測(cè)棕櫚酰酯氧化生成的3H2O線性增長速度來評(píng)價(jià)棕櫚酸酯氧化率,棕櫚酰酯氧化率單位以μmol/g/min表示。8.細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及處理：大鼠肌母細(xì)胞系H9C2 (cardiac myoblast)購于ATCC,于含5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)。所有病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為10的病毒量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。應(yīng)用去氧腎上腺素注射液(PE,20μm)刺激H9C2細(xì)胞系48小時(shí)構(gòu)建體外心肌細(xì)胞肥厚模型。9.細(xì)胞內(nèi)油紅0染色及膽固醇、甘油三酯定量分析：用10%的多聚甲醛固定細(xì)胞90分鐘,隨后在油紅O染液中孵育3小時(shí)后于顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況；細(xì)胞內(nèi)膽固醇和甘油三酯定量分析采用酶比色試劑盒(Wako)進(jìn)行測(cè)定。10.蛋白質(zhì)免疫印跡：將凍存的心肌組織和處理的細(xì)胞用裂解液裂解,提取總蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉后用特異性一抗4℃孵育過夜,然后二抗室溫2小時(shí)。ECL化學(xué)發(fā)光液顯影目的蛋白條帶,LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)。11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；多組之間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)及q檢驗(yàn)。設(shè)P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：1.SIRT3在小鼠肥厚心肌中表達(dá)降低我們給予小鼠TAC術(shù),并觀察6周。為確保主動(dòng)脈結(jié)扎成功,我們利用超聲心動(dòng)圖探查主動(dòng)脈結(jié)扎部位并測(cè)量其血流速度。我們通過計(jì)算小鼠心重與體重比值,發(fā)現(xiàn)小鼠心臟在結(jié)扎2周、4周、6周后分別產(chǎn)生20%、40%、60%的心肌肥厚。此外,我們發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比,短片段SIRT3在TAC術(shù)后明顯降低；而長片段SIRT3在輕度肥厚時(shí)輕度上升,在嚴(yán)重肥厚時(shí)并無明顯表達(dá)變化。這些結(jié)果與Sundaresan等在類似心肌肥厚疾病模型中獲得的結(jié)論一致,證實(shí)了短片段的去乙酰化蛋白SIRT3在小鼠肥厚心肌中表達(dá)降低。2.SIRT3-KO小鼠在TAC術(shù)后易于形成心肌肥厚為進(jìn)一步研究SIRT3在心肌肥厚中所起的作用,我們給與SIRT3-KO小鼠及野生型小鼠TAC術(shù)。我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比,SIRT3-KO小鼠TAC術(shù)后肥厚程度更加嚴(yán)重(15%)。在假手術(shù)組,SIRT3-KO小鼠亦出現(xiàn)比野生型小鼠更高的心重體重比。組織學(xué)檢查顯示,無論在TAC還是假手術(shù)組,SIRT3-KO小鼠心肌中表現(xiàn)出更加嚴(yán)重的細(xì)胞壞死和心肌纖維化。我們利用超聲心動(dòng)圖對(duì)小鼠心臟進(jìn)行無創(chuàng)評(píng)價(jià)：SIRT3-KO小鼠左室后壁在基礎(chǔ)水平及TAC術(shù)后均較野生型小鼠更厚。此外,左室短軸縮短率(Fraction Shortening, FS)分析顯示SIRT3-KO小鼠更加容易形成嚴(yán)重收縮功能障礙。這些研究發(fā)現(xiàn)SIRT3-KO小鼠在TAC術(shù)后易于出現(xiàn)心臟功能受損及心力衰竭,提示SIRT3在心肌肥厚的過程中發(fā)揮重要作用。3.SIRT3-KO小鼠心肌中出現(xiàn)過度脂質(zhì)積累及脂肪酸氧化速率降低我們利用透射電子顯微鏡觀察小鼠肥厚心肌,結(jié)果顯示肥厚心肌中線粒體形態(tài)出現(xiàn)嚴(yán)重病變。SIRT3-KO在正常情況下未表現(xiàn)出明顯的心肌表型變化；野生型和SIRT3-KO小鼠在TAC術(shù)后出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)累積；但是與野生型小鼠相比,SIRT3-KO小鼠出現(xiàn)更明顯的線粒體腫脹,線粒體嵴紊亂以及線粒體內(nèi)出現(xiàn)大量的泡沫。我們運(yùn)用其他代謝學(xué)檢測(cè)方法對(duì)小鼠心肌檢查后發(fā)現(xiàn),甘油三酯及膽固醇水平在TAC術(shù)后均升高,在SIRT3-KO、鼠心肌中甘油三酯升高的更加明顯,提示心肌細(xì)胞脂肪酸氧化功能受損,同時(shí)驗(yàn)證了電鏡掃描結(jié)果。為了直接評(píng)估脂肪酸氧化能力,我們利用棕櫚酸氧化率進(jìn)行測(cè)算。在野生型小鼠中,棕櫚酸氧化率降低30%,而在SIRT3-KO、鼠中,棕櫚酸氧化率在正常和肥厚狀態(tài)下均明顯降低�？傊�,結(jié)果顯示SIRT3-KO小鼠在心肌肥厚刺激后出現(xiàn)過度脂質(zhì)累積和脂肪酸氧化率降低。4.SIRT3調(diào)控LCAD的乙酰化狀態(tài)心肌細(xì)胞內(nèi)催化脂肪酸氧化的代謝酶均位于線粒體內(nèi),所以我們進(jìn)一步探討短片段的去乙�；鞍酌窼IRT3是否參與脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示SIRT3-KO小鼠的線粒體蛋白出現(xiàn)明顯的過度乙�；辉谝吧托∈笾�,線粒體蛋白出現(xiàn)明顯的過度乙�；野殡S著短片段SIRT3的降低。我們利用抗乙�；嚢彼峥贵w與內(nèi)源性的線粒體蛋白進(jìn)行免疫共沉淀,然后用抗LCAD抗體進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示LCAD在正常狀態(tài)下可以被乙酰化修飾,在心肌肥厚狀態(tài)下呈現(xiàn)過度乙�；癄顟B(tài)。當(dāng)我們對(duì)SIRT3-KO小鼠進(jìn)行同樣實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),LCAD在正常和肥厚兩種狀態(tài)下均顯示出明顯的過度乙�；癄顟B(tài)。這些結(jié)果顯示出SIRT3對(duì)于去乙�；疭IRT3具有必要作用。為了進(jìn)一步證明SIRT3可以直接去乙�；疞CAD,我們將Flag標(biāo)記的LCAD病毒載體與SIRT3病毒或空載體病毒共轉(zhuǎn)染小鼠心肌細(xì)胞。結(jié)果顯示,心肌細(xì)胞中過表達(dá)SIRT3可以降低LCAD的乙�；潭取？傊�,這些結(jié)果顯示去乙�；鞍酌窼IRT3可能通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)的LCAD的乙酰化狀態(tài)從而影響脂肪酸氧化作用。5.過表達(dá)SIRT3可以減少脂質(zhì)累積并抑制心肌肥厚反應(yīng)心肌細(xì)胞先進(jìn)行SIRT3或空載體病毒轉(zhuǎn)染48小時(shí),然后利用去氧腎上腺素(phenylephrine, PE,20μM)或空白對(duì)照(生理鹽水)刺激心肌細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT3可以降低心肌肥厚標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)；通過3H亮氨酸摻入率實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT3可以降低心肌細(xì)胞蛋白合成；同時(shí)過表達(dá)SlRT3可以降低ANF及β-MHC基因表達(dá)。此外,通過油紅O染色實(shí)驗(yàn),我們還觀察到PE刺激可以是心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴增多,而過表達(dá)SIRT3可以是心肌細(xì)胞內(nèi)脂滴減少。通過脂質(zhì)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),心肌細(xì)胞內(nèi)膽固醇和甘油三酯在PE刺激后均升高,過表達(dá)SIRT3可以使其分別降低40%和50%。這些結(jié)果顯示過表達(dá)SIRT3可能通過減低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積從而降低心肌細(xì)胞肥厚反應(yīng)。結(jié)論：1.SIRT3具有減輕心肌肥厚反應(yīng)的作用。2.SIRT3可以改善心肌肥厚中線粒體脂質(zhì)代謝障礙。3.SIRT3可以通過調(diào)節(jié)LCAD乙�；癄顟B(tài)改善心肌細(xì)胞線粒體脂肪酸氧化。研究背景心肌纖維化是一種廣泛存在于多種心臟疾病的病理過程,壓力超負(fù)荷性心臟病(如高血壓、主動(dòng)脈狹窄)因其能夠引起廣泛而嚴(yán)重的心肌纖維化越來越受到關(guān)注。在動(dòng)物模型中,壓力負(fù)荷過重在早期可引起心肌肥厚,心肌纖維化及舒張功能異常；在晚期則出現(xiàn)心臟功能失代償,具體表現(xiàn)擴(kuò)張性心肌病變及收縮功能減低。膠原纖維合成和分解方面的紊亂可導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常。纖維化可以使心臟收縮和舒張期心肌細(xì)胞電機(jī)械偶聯(lián)功能失調(diào),對(duì)心臟收縮和舒張功能產(chǎn)生損害。心肌間質(zhì)中膠原纖維累積增多可以導(dǎo)致室壁僵硬度增加,使心臟主動(dòng)舒張功能受損；反之,心肌間質(zhì)中過度激活的纖維化重構(gòu)往往涉及到細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解加強(qiáng),最終導(dǎo)致心室擴(kuò)張及收縮功能衰竭。心肌纖維化中膠原網(wǎng)絡(luò)功能異常常常通過以下機(jī)制導(dǎo)致收縮功能減低：第一,膠原纖維的喪失使心肌纖維收縮協(xié)調(diào)性降低,使得心肌細(xì)胞收縮無法轉(zhuǎn)化成正常的心肌收縮力；第二,心肌間質(zhì)中組成成分的相互作用(如層粘連蛋白,膠原及其受體)對(duì)于維持心肌細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)平衡具有重要作用；第三,心肌纖維化導(dǎo)致心肌細(xì)胞被心肌成纖維細(xì)胞取代,導(dǎo)致左室擴(kuò)張。心肌纖維化除了對(duì)心臟收縮舒張功能造成巨大影響外,還可通過介導(dǎo)異常折返通路形成從而產(chǎn)生心律失常。SIRT3是一類依賴NAD+的組蛋白去乙�；�,是唯一一個(gè)被證實(shí)其表達(dá)水平與人類壽命長度有關(guān)的Sirtuin。有研究表明運(yùn)動(dòng)和熱量攝入限制能夠升高SIRT3表達(dá)水平。SIRT3在游離脂肪酸氧化功能中發(fā)揮重要作用,對(duì)于維持細(xì)胞ATP水平具有重要意義。在心臟中,SIRT3具有抵抗氧化應(yīng)激損傷作用從而保護(hù)心肌細(xì)胞,抑制心肌肥厚形成。SIRT3能夠通過去乙酰化調(diào)節(jié)多種代謝酶和轉(zhuǎn)錄因子的乙�；癄顟B(tài)從而影響其活性,參與能量產(chǎn)生,底物代謝,ROS等多種細(xì)胞內(nèi)通路的調(diào)節(jié),但是關(guān)于SIRT3在心肌纖維化方面的研究較少。如何健康而長壽的生存一直是令人神往的問題,既往研究發(fā)現(xiàn)熱量攝入限制(Calorie restriction, CR)被認(rèn)為是一條重要的方法。但在現(xiàn)代社會(huì),食物來源過度豐富以及可利用時(shí)間大大減少均使得CR成為不太可能實(shí)踐的一種方式。盡管接種疫苗、使用抗生素、更好的兒童醫(yī)療保護(hù)以及疾病早期診療措施的聯(lián)合應(yīng)用能夠幫助延長人類的平均壽命,如何能延長人類的最大壽命限度仍然有待研究。在過去20年衰老領(lǐng)域中的研究中,最大的進(jìn)展是CR有利方面的重大發(fā)現(xiàn)及這些有利方面背后的分子學(xué)機(jī)制。許多研究提示CR的保護(hù)作用依賴于Sirtuins參與。盡管CR對(duì)人類健康具有重要的保護(hù)作用,這樣一種飲食方式似乎并不可能被廣泛采用和接受,因?yàn)镃R可能對(duì)衰弱、嚴(yán)重疾患及老年患者造成重大威脅。因此能夠提供類似CR有利作用且不限制熱量攝入限制的CR模擬物成為研究熱點(diǎn)。白藜蘆醇(Resveratrol, RSV)是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可以通過模擬CR作用從而激活Sirtuin的藥物,小鼠長期接受RSV注射可以引起CR類似的基因表達(dá)變化,推遲年齡相關(guān)的退化。此外,RSV能夠抑制自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous Hypertension Rat, SHR)心肌肥厚及纖維化。上述研究提示SIRT3在心肌細(xì)胞保護(hù)方面具有重要作用,而且熱量攝入限制和Sirtuin激活的有利作用使得Sirtuin的小分子激活劑成為研究的熱點(diǎn)。本研究擬以胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)(TAC)構(gòu)建壓力負(fù)荷性小鼠心肌肥厚模型,探討SIRT3在心肌纖維化中的作用機(jī)制,并進(jìn)一步通過體外誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化,研究SIRT3在該過程中對(duì)纖維化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TGF-β/SMAD的調(diào)節(jié)作用,明確其可能的作用機(jī)制及信號(hào)通路。研究目的：1.探討SIRT3對(duì)壓力超負(fù)荷引起的心肌纖維化的影響。2.研究白藜蘆醇對(duì)小鼠心肌中SIRT3表達(dá)水平的影響。3.探討SIRT3激活通過何種途徑減輕心肌纖維化。研究方法：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定和國家衛(wèi)生部動(dòng)物管理辦法(文案號(hào)No.55,2001)。6-7周齡雄性129野生型小鼠購自北京大學(xué)動(dòng)物研究所,SIRT3-K 0小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室。2.動(dòng)物飲食：我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中給予動(dòng)物熱量攝入限制飲食(CR),普通對(duì)照飲食(Control Dietary,CD)及白藜蘆醇補(bǔ)充飲食(RSV supplemental, RSV)。根據(jù)AIN-93M (BioServ, Frenchtown, NJ)飲食推薦,我們給予CD組小鼠每周86.4 kcal的食物熱量供應(yīng),給予CR組小鼠每周64.8 kcal的食物熱量供應(yīng)。RSV組小鼠給予普通對(duì)照飲食加1.8mg/kg/天的含RSV的飼養(yǎng)用水供應(yīng)。3.構(gòu)建小鼠心肌纖維化模型：我們采用胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)(TAC)建立8周齡雄性小鼠(年齡匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠)反應(yīng)性心肌纖維化動(dòng)物模型。我們采用戊巴比妥鈉對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉,將胸主動(dòng)脈從周圍組織中分離出來,將27號(hào)空針針頭(27-gauge needle)放置于兩側(cè)頸總動(dòng)脈之間,然后進(jìn)行手術(shù)縫線結(jié)扎,迅速將針頭移除。除結(jié)扎外,假手術(shù)組動(dòng)物被給予相同處理。所有動(dòng)物在術(shù)后8周處死,將小鼠心臟取材進(jìn)行肥厚和纖維化等方面的研究。4.免疫組織化學(xué)：取材后,組織切片進(jìn)行HE染色觀察形態(tài),進(jìn)行天狼星紅染色來評(píng)估膠原含量。膠原含量采用自動(dòng)圖像分析軟件(Image Pro Plus)進(jìn)行定量分析。5.超聲心動(dòng)圖：采用異氟烷吸入麻醉,采用VisualSonics Vevo 770小動(dòng)物超聲30-Mz進(jìn)行左室長軸測(cè)量,分別采用M-mode、二維超聲心動(dòng)圖(2-D)、脈沖多普勒超聲(PulseWave Doppler, PWD)等模式進(jìn)行圖形采集并分析。6.原代心肌成纖維細(xì)胞分離和培養(yǎng)：我們提取大鼠乳鼠(1-3d)心臟中心肌成纖維細(xì)胞。采用含10%胎牛血清及雙聯(lián)抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞,將細(xì)胞置于含5%C02的37℃孵箱中培養(yǎng)。7.體外誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化：采用血管緊張素2(Angll,1 μ mol/L)刺激心肌成纖維細(xì)胞,誘導(dǎo)其向心肌成纖維細(xì)胞分化。8.細(xì)胞免疫熒光：將細(xì)胞置于4%多聚甲醛中固定15分鐘,將固定好的細(xì)胞置于4℃冰箱,采用1：200稀釋的SMA或Smad3一抗過夜孵育,細(xì)胞熒光采用激光共聚焦顯微鏡及軟件進(jìn)行分析。9.蛋白質(zhì)免疫印跡：將凍存的心肌組織和處理的細(xì)胞用裂解液裂解,提取總蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉后用特異性一抗4℃孵育過夜,然后二抗室溫2小時(shí)。ECL化學(xué)發(fā)光液顯影目的蛋白條帶,LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)。10.實(shí)時(shí)定量PCR分析：采用Trizol法提取心肌組織及細(xì)胞中的RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR green法測(cè)定組織和細(xì)胞中目的基因的表達(dá)量。11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；多組之間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)及q檢驗(yàn)。設(shè)P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：1.RSV可升高小鼠心肌SIRT3表達(dá)水平我們給予野生型小鼠組熱量攝入限制飲食(CR)和白藜蘆醇補(bǔ)充飲食(RSV)8周,發(fā)現(xiàn)CR組心肌組織內(nèi)SIRT3表達(dá)水平較對(duì)照組升高1倍以上(*p0.05)。此外,白藜蘆醇干預(yù)(RSV, 1.8 mg·kg-1·day-1)可以引起與CR作用類似的SIRT3表達(dá)水平升高。隨后,我們給予野生型小鼠組及SIRT3/-/小鼠組TAC術(shù)及假手術(shù)組處理(小鼠按不同進(jìn)食方式進(jìn)行喂養(yǎng)直至安樂死)。在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到SlRT3在TAC術(shù)后水平降低50%,而白藜蘆醇干預(yù)可維持小鼠心肌內(nèi)SIRT3的表達(dá)水平。2.白藜蘆醇抗心肌肥厚作用依賴于SIRT3參與根據(jù)心重/體重比值測(cè)量,SIRT3-./-小鼠組在壓力超負(fù)荷刺激下產(chǎn)生更加嚴(yán)重的心肌肥厚(73%in SIRT3 KO+vehicle+TAC組；32%in WT+vehicle+TAC組,*p0.05),白藜蘆醇干預(yù)可減輕野生型小鼠組心肌肥厚狀態(tài),但在SIRT3-/-小鼠組未起到保護(hù)作用。白藜蘆醇干預(yù)可以降低其他心肌肥厚標(biāo)志物水平,如ANP,Myh-7,但在SlRT3-/-小鼠組未能降低此類胎性基因表達(dá),上述結(jié)果提示白藜蘆醇改善心肌肥厚作用依賴于SIRT3參與。3.白藜蘆醇激活SIRT3可以改善心肌舒縮功能我們對(duì)小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè),結(jié)果顯示在壓力超負(fù)荷刺激下,SIRT3-/-小鼠組左室后壁厚度較野生型小鼠組更加肥厚(1.45±0.07 mm,*p0.05)。左室短軸縮短率在TAC術(shù)后明顯降低,尤其在SⅠRT3-/-組,但左室射血分?jǐn)?shù)在兩組間無明顯差別。在我們的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)壓力超負(fù)荷容易造成心臟舒張功能異常,其中Aa速度升高及Ea/Aa比值降低均提示舒張功能減低。在我們的研究中發(fā)現(xiàn),SIRT3-/-小鼠組及野生型小鼠組在TAC術(shù)后舒張功能均下降,尤其在SIRT3-/-小鼠中更為明顯。白藜蘆醇可以改善野生型小鼠組心臟舒張功能,但在SIRT3-/-小鼠組未起到明顯改善作用。上述研究證實(shí)白藜蘆醇激活SIRT3可以改善心肌功能,尤其是舒張功能。4.白藜蘆醇激活SIRT3可以減輕心肌纖維化心肌纖維化心肌重構(gòu)的一個(gè)重要特征。我們對(duì)心肌組織進(jìn)行天狼星紅染色并于偏振光顯微鏡下觀察。在壓力超負(fù)荷刺激下,SIRT3-/-小鼠組和野生型小鼠組均較假手術(shù)組纖維化水平更高,且SIRT3-/-小鼠可自發(fā)形成心肌纖維化。白藜蘆醇干預(yù)可以減輕野生型小鼠心肌纖維化,但在SIRT3-/-小鼠中未觀察到此保護(hù)作用,提示白藜蘆醇的抗纖維化作用依賴于SIRT3參與。通過Western blot檢測(cè),心臟中膠原l和膠原Ⅲ在TAC術(shù)后表達(dá)水平增高。白藜蘆醇可以降低野生型小鼠組肥厚心肌中膠原纖維的累積,但并未降低SIRT3+小鼠中的膠原表達(dá)。5.白藜蘆醇激活SIRT3可以抑制促纖維化分子表達(dá)TGF-β、α-SMA及TIMP-2是細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解的標(biāo)志物。SIRT3-/-和野生型小鼠組在TAC術(shù)后促纖維化因子水平均升高。白藜蘆醇干預(yù)可降低野生型小鼠組TGF-β、α-SMA及TIMP-2水平,但是未能降低SlRT3-/-小鼠促纖維化因子表達(dá)。TGF-β受體(TRβ1和TRβ2)可以增加SMAD3的磷酸化水平,纖維化中TGF-β通路激活表現(xiàn)在P-SMAD3水平升高。白藜蘆醇干預(yù)可以降低TGF-β受體表達(dá)水平,降低SMAD3的磷酸化水平,但在SlRT3-/-小鼠中并未觀察到此作用。因此,白藜蘆醇激活SIRT3可以降低促纖維化因子TGF-β、α-SMA及TIMP-2表達(dá)水平,并可能通過抑制TGF-β/Smad3通路改善心肌纖維化。6.白藜蘆醇可激活心肌成纖維細(xì)胞中SIRT3,并抑制肌成纖維細(xì)胞分化我們利用不同濃度的白藜蘆醇(0-100μM)刺激心肌成纖維細(xì)胞24h,發(fā)現(xiàn)80μM白藜蘆醇可以將SIRT3表達(dá)水平升高2倍以上。隨后,我們用80μM白藜蘆醇刺激心肌成纖維細(xì)胞48h,發(fā)現(xiàn)80μM白藜蘆醇刺激18h可升高SIRT3表達(dá)水平2倍以上。我們利用血管緊張素2(Angll)刺激誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化,發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞重要標(biāo)志物α-SMA在Angll刺激后表達(dá)明顯升高。白藜蘆醇刺激可以明顯降低心肌成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá),但當(dāng)使用小干擾RNA降低SIRT3表達(dá)時(shí),白藜蘆醇未能降低α-SMA表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可降低Angll升高的TGF-β及α-SMA基因表達(dá)水平,當(dāng)給予小干擾RNA降低SIRT3表達(dá)時(shí),白藜蘆醇未能降低TGF-β及α-SMA基因表達(dá)水平。7.白藜蘆醇激活SIRT3可抑制TGF-β通路及轉(zhuǎn)錄因子SMAD3活性我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到,TGF-β在體內(nèi)和體外纖維化模型中表達(dá)均升高,為了探討SIRT3抗纖維化作用是否與TGF-β通路抑制有關(guān),我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到白藜蘆醇干預(yù)可以降低TGF-β受體(TGF-β1, TGF-β2)、P-SMAD3及總SMAD3表達(dá)水平。且作為轉(zhuǎn)錄因子SMAD3的靶基因--纖溶酶原激活物抑制物1(PAl-1)其表達(dá)水平也被SIRT3下調(diào)。因此白藜蘆醇激活SIRT3可能通過抑制TGF-β通路起到改善心肌纖維化的作用。TGF-β通路發(fā)揮促纖維化作用依賴于磷酸化的SMAD3,因其磷酸化后通過核轉(zhuǎn)位作用進(jìn)入胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。隨后,通過細(xì)胞免疫熒光方法及Western blot技術(shù)我們觀察到Angll刺激可以誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞中SMAD3的核轉(zhuǎn)位作用,白藜蘆醇干預(yù)抑制了SMAD3的核轉(zhuǎn)位作用,但當(dāng)給予小干擾RNA時(shí),白藜蘆醇這一抑制作用消失。上述結(jié)果提示白藜蘆醇激活SIRT3的抗纖維化作用部分依賴于抑制TGF-β/SMAD3通路。結(jié)論：1.SIRT3激活可抑制心肌纖維化及心臟功能減低2.白藜蘆醇可升高小鼠心肌內(nèi)SIRT3表達(dá)水平。3.SIRT3的抗心肌纖維化作用依賴于對(duì)TGF-β/SMAD3通路的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：SIRT3 心肌肥厚 脂質(zhì)累積 長鏈脂酰輔酶A脫氫酶 去乙酰化蛋白酶SIRT3 心肌纖維化 轉(zhuǎn)化生長因子-β
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.2
【目錄】：

• 論文一：SIRT3對(duì)小鼠心肌肥厚中線粒體脂質(zhì)代謝障礙的影響及其機(jī)制研究8-66
• 中文摘要Ⅰ8-14
• 英文摘要Ⅰ14-22
• 符號(hào)說明Ⅰ22-24
• 前言24-27
• 材料與方法27-42
• 結(jié)果42-46
• 討論46-50
• 創(chuàng)新點(diǎn)50
• 局限性50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 附圖55-66
• 論文二：SIRT3激活對(duì)小鼠心肌肥厚中纖維化的影響及機(jī)制研究66-124
• 中文摘要Ⅱ66-73
• 英文摘要Ⅱ73-82
• 符號(hào)說明Ⅱ82-84
• 前言84-87
• 材料與方法87-101
• 結(jié)果101-105
• 討論105-108
• 創(chuàng)新點(diǎn)108
• 局限性108
• 結(jié)論108-109
• 參考文獻(xiàn)109-113
• 附圖113-124
• 致謝124-125
• 攻讀博士學(xué)位期間科研情況125-126
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表126-127
• 已發(fā)表英文論著Ⅰ127-156
• 已發(fā)表英文論著II156-183

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 喻倫銀,劉漢橋;錳對(duì)培養(yǎng)的小鼠心肌超氧化物歧化酶活性的影響[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;1991年04期

2 金玉蘭,岑浩望,陳鋼;衰竭性運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠心肌結(jié)構(gòu)影響的初步觀察[J];中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志;1992年01期

3 張為式;李亦秀;崔英梅;谷春山;孫尚奎;李文漢;;衛(wèi)矛對(duì)小鼠心肌攝取~(131)銫的影響[J];中國藥學(xué)雜志;1981年07期

4 白忠貞,韓惠芬,高秀峰;噪聲對(duì)小鼠心肌鈣、鎂代謝影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];職業(yè)醫(yī)學(xué);1991年05期

5 王永梅,王雪峰;克隆測(cè)序技術(shù)在小鼠心肌炎實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用[J];遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2004年01期

6 沈筱云;羅健東;;音猬因子在正常小鼠和糖尿病小鼠心肌中的表達(dá)比較[J];廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2007年06期

7 黃偉民;閻徐鈞;;黃連素對(duì)小鼠心肌內(nèi)總鈣濃度的影響[J];中國藥學(xué)雜志;1990年01期

8 潘毅生,張小娜,吳崇杰,刁勝林,呂興盛;心88對(duì)小鼠耐缺氧及其心肌攝取~(86)銣能力的影響[J];湛江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1991年01期

9 孫常義,王偉平,裴海泓;黨參對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌作用的影響[J];吉林工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1998年04期

10 劉敏;陳志武;;槲皮素-3-葡萄糖苷對(duì)小鼠心肌缺血缺氧損傷的保護(hù)作用[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年06期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 路義鑫;韓彩霞;張子群;李曉云;趙宇;宋銘忻;;瘦素與巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子對(duì)感染旋毛蟲小鼠心肌損傷致病機(jī)制的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

2 周正質(zhì);郭萍;劉常五;黃良月;;地奧心血康對(duì)小鼠心肌營養(yǎng)性血流量的影響[A];心腦病藥物臨床評(píng)價(jià)專家談[C];1998年

3 金宏;許志勤;王先遠(yuǎn);南文考;高蘭興;;肌酸對(duì)改善運(yùn)動(dòng)大鼠和小鼠心肌功能的作用[A];中國生理學(xué)會(huì)第六屆應(yīng)用生理學(xué)委員會(huì)全國學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

4 徐蕾;韓國柱;孫慧君;;應(yīng)用IP-RP-HPLC法測(cè)定大鼠及小鼠心肌中磷酸肌酸及其代謝產(chǎn)物的含量[A];第九屆全國藥物和化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

5 張健發(fā);馬依彤;楊毅寧;劉芬;陳邦黨;李曉梅;向陽;;后適應(yīng)缺血時(shí)間窗的選擇對(duì)小鼠心肌再灌注損傷的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)第十次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2008年

6 孫香蘭;Laurie Goodyear;高聆;趙家軍;;SNARK調(diào)節(jié)小鼠心肌運(yùn)動(dòng)及缺血刺激的葡萄糖攝取[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

7 付穎;王麗宏;李強(qiáng);艾靜;;Visfatin在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心肌中的表達(dá)[A];2009中國醫(yī)師協(xié)會(huì)內(nèi)分泌代謝科醫(yī)師分會(huì)年會(huì)論文匯編[C];2009年

8 楊戈;歐陽五慶;劉玉梅;王俊;張黎;楊光敏;;EMP對(duì)果蠅抗衰老和小鼠心肌抗氧化作用的研究[A];全國動(dòng)物生理生化第十次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2008年

9 韓彩霞;張子群;路義鑫;李曉云;趙宇;宋銘忻;;瘦素與巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子對(duì)感染旋毛蟲小鼠心肌損傷致病機(jī)制的研究[A];第3屆全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

10 趙yN鐳;王晨;杜智敏;;膽堿通過調(diào)節(jié)miR-133a抗小鼠心肌肥厚作用及機(jī)制研究[A];2012年中國藥學(xué)大會(huì)暨第十二屆中國藥師周論文集[C];2012年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 陳桐帥;SIRT3對(duì)小鼠心肌肥厚中線粒體脂質(zhì)代謝障礙及纖維化的影響及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

2 李傳保;乙醛脫氫酶2對(duì)代謝綜合征小鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

3 邸若岷;雷帕霉素改善小鼠心肌梗死后心室重構(gòu)的分子機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

4 程姝娟;Toll樣受體4在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠心肌炎癥因子表達(dá)和左室功能不全中的作用[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2004年

5 王振華;新生小鼠心肌再生機(jī)制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

6 陳蓉;蛇床子素抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌纖維化及其機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2012年

7 王永梅;黃芩甙抗CVB_（3m）和調(diào)控CVB_（3m）感染小鼠心肌免疫損傷及細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2003年

8 周密;MiR-17-92簇在小鼠心肌缺血—再灌注中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

9 劉銳;心外膜在新生小鼠心肌再生過程中作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳元元;胰島素樣生長因子Ⅱ受體在病毒性心肌炎小鼠心肌中的表達(dá)上調(diào)[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

2 劉浩;不同負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠心肌血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響[D];武漢體育學(xué)院;2007年

3 楊戈;玉米幼芽提取物對(duì)果蠅抗衰老和小鼠心肌抗氧化作用的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

4 關(guān)煜;LY-96在小鼠心肌肥厚及纖維化中的作用研究[D];華中科技大學(xué);2013年

5 曹琳琳;烏蘇里藜蘆生物堿對(duì)小鼠心肌肥大保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2008年

6 劉波;雷帕霉素干預(yù)炎癥因子對(duì)小鼠心肌梗死的保護(hù)作用[D];華中科技大學(xué);2012年

7 趙宇;瘦素與巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子對(duì)感染旋毛蟲小鼠心肌損傷致病機(jī)制的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

8 陳琛;耐力、抗阻和混合訓(xùn)練對(duì)TNF-α介導(dǎo)的C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[D];華東師范大學(xué);2010年

9 付珊珊;依那普利對(duì)新方法造小鼠心肌梗死模型外周血TNF-α、Th1/Th2、Treg/Th17的調(diào)節(jié)作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

10 王悅;A乳劑對(duì)阿霉素所致小鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[D];沈陽藥科大學(xué);2009年

  本文關(guān)鍵詞：SIRT3對(duì)小鼠心肌肥厚中線粒體脂質(zhì)代謝障礙及纖維化的影響及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：255085