【摘要】：Tim-3于2001年被發(fā)現(xiàn),屬于Tim(T-Cell-Ig-mucin)家族的一員。Tim-3起初被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面。Tim-3與其配體Gal-9結(jié)合后,能抑制T細(xì)胞功能。Tim-3在T細(xì)胞的高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤及感染性疾病的免疫耐受,被認(rèn)為是繼CTLA-4,PD-1之后的新一代免疫干預(yù)靶點(diǎn)。我們前期研究發(fā)現(xiàn),Tim-3不只作用于T細(xì)胞,也抑制巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞的功能。Tim-3能通過結(jié)合STAT1,抑制STAT1-miRNA155通路,從而抑制巨噬細(xì)胞向M1方向極化。Tim-3還能抑制LPS誘導(dǎo)的NF-kB活化,負(fù)性調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能。單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種人畜共患病的病原菌。李斯特菌因為具有危害相對較低,易于體外培養(yǎng)等特點(diǎn)而成為研究胞內(nèi)菌感染的模型。它主要以食物為傳染媒介,能引起人、畜李斯特菌病,感染后主要癥狀為敗血癥和腦膜炎。單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種胞內(nèi)寄生菌。胞內(nèi)寄生菌是指能侵入細(xì)胞繁殖、隨細(xì)胞播散,并逃避抗體攻擊的一類致病菌。其中包括鼠疫桿菌、布魯氏菌和結(jié)核桿菌等烈性傳染病。單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)入體內(nèi)首先在模式識別受體的協(xié)助下被巨噬細(xì)胞吞噬。然后巨噬細(xì)胞啟動呼吸氧爆發(fā)等多種應(yīng)激機(jī)制,介導(dǎo)對李斯特菌的殺傷。最后抗原表位經(jīng)加工、處理,由MHC-I類分子呈遞至CD8+T細(xì)胞后,CD8+T細(xì)胞分化成CTL細(xì)胞殺傷感染李斯特菌的細(xì)胞,來消滅李斯特菌感染。Tim-3在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮抑制作用,巨噬細(xì)胞在抗李斯特菌感染中發(fā)揮重要作用。在巨噬細(xì)胞中通過基因芯片發(fā)現(xiàn),Tim-3能抑制抗感染免疫相關(guān)分子CD36和MHC-I類分子的表達(dá)。那么提出假設(shè),Tim-3可能通過影響巨噬細(xì)胞,進(jìn)而抑制機(jī)體抗感染功能。如果能,那Tim-3又是通過什么機(jī)制來影響巨噬細(xì)胞的抗感染功能的?為了探索這個問題,在轉(zhuǎn)基因高表達(dá)Tim-3和阻斷Tim-3信號的小鼠中發(fā)現(xiàn),Tim-3能抑制小鼠防御單核細(xì)胞增生李斯特菌的感染。轉(zhuǎn)基因高表達(dá)Tim-3小鼠腹腔和脾臟細(xì)菌載量增加,肝臟損傷加重。小鼠體內(nèi)阻斷Tim-3信號則損傷減輕。在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn),Tim-3抑制抗感染免疫是通過抑制巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌吞噬、殺傷和抗原遞呈功能實現(xiàn)的。Tim-3通過抑制Nrf2-CD36抑制巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的吞噬。用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn),Tim-3高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的吞噬量顯著低于正常野生型小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬量。與此同時,加入stim-3蛋白阻斷tim-3信號的raw264.7細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的吞噬量顯著高于加入對照蛋白的raw264.7細(xì)胞的吞噬量。通過基因芯片、rt-pcr與流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn),tim-3高表達(dá)會抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)cd36,而阻斷tim-3信號會促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)cd36。加入sso和stim-3阻斷蛋白用流式細(xì)胞儀檢測對單核細(xì)胞增生李斯特菌的吞噬發(fā)現(xiàn),cd36能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的吞噬,而tim-3主要是通過抑制cd36的表達(dá)從而抑制巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的吞噬。通過免疫沉淀、westernblotting和高內(nèi)涵分析,tim-3信號高表達(dá)不但能通過增加nrf2泛素化來降低nrf2蛋白的表達(dá)水平,還能抑制nrf2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能。同時,阻斷tim-3信號則可以通過降低泛素化來增加nrf2蛋白的表達(dá)水平,還能促進(jìn)nrf2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能。通過流式細(xì)胞檢測,nrf2sirna敲低的raw264.7細(xì)胞能顯著抑制stim-3蛋白阻斷tim-3信號后引起的raw264.7細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的吞噬增多。而且通過流式細(xì)胞檢測,敲低raw264.7細(xì)胞的nrf2表達(dá)或加入脫泛素酶抑制劑pr619抑制nrf2脫泛素后,能顯著抑制stim-3蛋白阻斷tim-3信號后引起的raw264.7細(xì)胞cd36的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果從多個方向說明,tim-3抑制巨噬細(xì)胞的cd36的表達(dá),從而抑制巨噬細(xì)胞對病原微生物的吞噬功能,主要是通過抑制nrf2泛素化來降低nrf2蛋白的表達(dá)水平和抑制nrf2核轉(zhuǎn)位發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能。tim-3通過抑制nrf2-ho-1抑制巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的殺傷。用cfu計數(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn),tim-3高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的殺傷量顯著低于正常野生型小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的殺傷量。與此同時,加入stim-3蛋白阻斷tim-3信號的raw264.7細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的殺傷量顯著高于加入對照蛋白的raw264.7細(xì)胞的殺傷量。通過rt-pcr分析,tim-3高表達(dá)會抑制腹腔中巨噬細(xì)胞表達(dá)ho-1,阻斷tim-3信號會促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)ho-1。敲低raw264.7細(xì)胞的nrf2表達(dá)或加入脫泛素酶抑制劑pr619抑制nrf2脫泛素后,能顯著抑制stim-3蛋白阻斷tim-3信號后引起的raw264.7細(xì)胞ho-1的表達(dá)上調(diào)。阻斷tim-3信號會促進(jìn)raw264.7細(xì)胞表達(dá)il-1β,tim-3通過ho-1影響il-1β的表達(dá),從而影響機(jī)體對單核細(xì)胞增生李斯特菌的殺傷。Tim-3抑制巨噬細(xì)胞的HO-1的表達(dá),從而抑制IL-1β分泌與巨噬細(xì)胞對病原微生物的殺傷功能,主要是通過抑制Nrf2泛素化來降低Nrf2蛋白的表達(dá)水平和抑制Nrf2核轉(zhuǎn)位發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能。Tim-3通過抑制NLRC5-MHC-I抑制巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抗原遞呈功能。通過RT-PCR和流式細(xì)胞分析,Tim-3高表達(dá)會抑制腹腔中巨噬細(xì)胞MHC-I類分子的表達(dá),阻斷Tim-3信號會促進(jìn)巨噬細(xì)胞MHC-I類分子的表達(dá)。Tim-3高表達(dá)會抑制小鼠腹腔中的巨噬細(xì)胞MHC-I類分子對OVA257-264的體外抗原遞呈。阻斷Tim-3信號會促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對MHC-I類分子對OVA257-264的體外抗原遞呈。Tim-3高表達(dá)會抑制小鼠腹腔中的巨噬細(xì)胞在單核細(xì)胞增生李斯特菌感染過程中MHC-I類分子對OVA257-264的抗原遞呈進(jìn)而抑制MHC-I類分子對CD8+T細(xì)胞的激活。通過Western Blotting,RT-PCR和雙熒光素酶報告分析,阻斷Tim-3通過STAT1促進(jìn)巨噬細(xì)胞NLRC5的表達(dá)。Tim-3高表達(dá)能通過抑制巨噬細(xì)胞STAT1對NLRC5的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而降低NLRC5的蛋白表達(dá)水平。通過流式細(xì)胞、RT-PCR和雙熒光素酶報告分析,敲低RAW264.7細(xì)胞的NLRC5表達(dá)后,能顯著抑制sTim-3蛋白阻斷Tim-3信號后引起的RAW264.7細(xì)胞MHC-I的表達(dá)上調(diào)。轉(zhuǎn)入Tim-3質(zhì)粒的HEK-293-T細(xì)胞的NLRC5-MHC-I報告的熒光素表達(dá)水平明顯少于未轉(zhuǎn)入Tim-3質(zhì)粒的HEK-293-T細(xì)胞。這些結(jié)果從多個方面說明,Tim-3高表達(dá)會通過STAT1、NLRC5抑制腹腔中巨噬細(xì)胞MHC-I類分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)了Tim-3能抑制小鼠對單核細(xì)胞增生李斯特菌感染的抵抗,其中主要包括通過Tim-3-Nrf2-CD36通路抑制巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的吞噬,通過Tim-3-Nrf2-HO-1通路抑制巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的殺傷,通過Tim-3-STAT1-NLRC5-MHC-I通路抑制巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抗原遞呈功能和對殺傷性CD8+T細(xì)胞的激活。因此,Tim-3抑制抗感染免疫是通過抑制巨噬細(xì)胞對單核細(xì)胞增生李斯特菌的吞噬、殺傷和抗原遞呈功能來實現(xiàn)的。本項研究充分證明Tim-3作為共抑制分子的一員,在抗感染免疫的過程中發(fā)揮重要作用,為共抑制分子的研究提供了新的視野。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：2550072