本文關(guān)鍵詞：O-甘露聚糖和甘露戊糖的高效合成研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細胞表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖鏈在生物體內(nèi)多種生理和病理過程中扮演著重要角色。然而,由于自然界中糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性很難通過天然提取分離的手段獲得足夠量、高純度的生物活性寡糖及其綴合物,因而糖鏈樣品的來源成為制約糖結(jié)構(gòu)和功能研究的一大瓶頸。而采用化學(xué)法和酶法進行體外寡糖合成則為糖鏈的獲得提供了嶄新的途徑,是近年來糖科學(xué)研究的難點、熱點和前沿領(lǐng)域。本論文以解決兩類生物活性寡糖的來源性問題為目標(biāo),主要完成了兩部分工作：1.完成了6個Core M1 O-甘露聚糖(O-mannose glycans)分子的化學(xué)酶法合成；2.完成了1個非對稱3,6-分支甘露戊糖(Man5)的化學(xué)合成。1 Core Ml O-甘露聚糖的化學(xué)酶法合成O-甘露聚糖因其豐富的結(jié)構(gòu)多樣性和重要的生物學(xué)功能已成為近年來糖生物學(xué)研究的新熱點和前沿領(lǐng)域。肌營養(yǎng)不良相關(guān)蛋白聚糖(a-dystroglycan, a-DG)表面的O-甘露聚糖能夠與肌細胞外基質(zhì)分子相結(jié)合以維持抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合物(dystrophin-glycoprotein complex, DGC)的正常結(jié)構(gòu)和功能。因糖鏈生物合成途徑異常而造成的α-DG表面O-甘露聚糖低表達,會引起各種類型先天性肌營養(yǎng)不良(congenital muscular dystrophies, CMDs)。此外,O-甘露聚糖還與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和某些病毒對宿主細胞的入侵有密切關(guān)系。然而目前,O-甘露聚糖的生物合成途徑及其與細胞外基質(zhì)分子間相互作用的構(gòu)效關(guān)系尚不十分清楚。要解決這些問題,首先就要獲得足夠量高純度的O-甘露聚糖分子探針,結(jié)合糖的微陣列技術(shù)以發(fā)現(xiàn)生物合成途徑中的相關(guān)酶類并揭示其催化機制,并在分子水平上深入研究這些糖鏈與細胞外基質(zhì)分子間相互作用的機制。然而,由于立體選擇性構(gòu)建O-甘露聚糖結(jié)構(gòu)中的唾液酸和巖藻糖糖苷鍵的挑戰(zhàn)性,加之O-甘露聚糖結(jié)構(gòu)的高度多樣性,O-甘露聚糖的合成研究還遠遠落后于其生物活性研究：(1)已發(fā)展的策略均以某一個糖鏈結(jié)構(gòu)為目標(biāo)分子,且僅實現(xiàn)了O-甘露聚糖中2個結(jié)構(gòu)(一個Core M1四糖和一個Core M3三糖)的合成;(2)已發(fā)展的化學(xué)合成策略存在路線冗長、糖苷化反應(yīng)選擇性低、工作量大而總收率低等多種弊端,已報道的酶法合成也多受限于所采用的哺乳動物酶的催化效率低、可溶性表達量低、底物適應(yīng)性差等缺陷；(3)對于Core M1系列中更為復(fù)雜的含有N-羥乙酰神經(jīng)氨酸化的N-乙酰乳糖胺(sLNGc)、路易斯X (Lewis x,Lex)和唾液酸化路易斯X(sialyl Lewis x, sLex)單元的四糖和五糖分子則尚未實現(xiàn)任何形式的合成。因此,急需發(fā)展一種能夠覆蓋盡可能多的該系列寡糖結(jié)構(gòu)的多樣化導(dǎo)向的高效合成策略。針對上述問題,本論文發(fā)展了一個多樣化導(dǎo)向的基于連續(xù)“一鍋多酶”(one-pot multi-enzyme, OPME)糖苷化的Core M1 O-甘露聚糖化學(xué)酶法合成策略,主要開展了以下幾方面工作：(1) Core M1 O-甘露二糖氨基酸的化學(xué)法合成采用基于丁二酮、叔丁基二甲基硅基的保護基策略和兩步高效的化學(xué)糖苷化反應(yīng),靈活高效地合成了末端連有絲氨酸的Core M1 O-甘露聚糖核心二糖。(2) Core M1 O-甘露聚糖糖鏈的酶法延伸以化學(xué)合成的Core M1 O-甘露二糖絲氨酸為起始底物,將三個細菌來源的分別用于β1-4半乳糖苷鍵、α2-3唾液酸糖苷鍵、α1-3巖藻糖苷鍵構(gòu)建的“一鍋多酶”糖苷化體系用于Core M1 O-甘露聚糖糖鏈的仿生化延伸,并合理調(diào)整酶催化反應(yīng)順序,實現(xiàn)了Core M1 O-甘露聚糖分子的多樣化合成。最終以每步酶反應(yīng)70%以上的收率首次實現(xiàn)了6個末端連有絲氨酸的CoreM1 O-甘露聚糖的高效、大量合成,其中包括含有sLNGc、Lex、sLex單元的復(fù)雜Core M1 O-甘露四糖和五糖的首次全合成。2非對稱3,6-分支甘露戊糖(Man5)的化學(xué)合成Man5是寡聚甘露糖和復(fù)雜型N-聚糖所共有的核心結(jié)構(gòu),也是HIV-1包膜糖蛋白gp120表面糖鏈中含量最為豐富的結(jié)構(gòu)。大量證據(jù)表明,Man5結(jié)構(gòu)域是HIV人單克隆抗體2G12的識別位點,也是可與HIV包膜結(jié)合的凝集素cyanovirin-N (CVN)的最初結(jié)合靶點。因而以Man5為基礎(chǔ)構(gòu)建成簇抗原表位是抗HIV糖疫苗研究的熱點,且gp120寡聚甘露糖與受體相互作用的研究也需要大量高純度Man5樣品。然而,目前寡聚甘露糖的制備多采用化學(xué)合成,且多集中在線性結(jié)構(gòu)和對稱的分支結(jié)構(gòu)上,對此非對稱分支Man5尚未發(fā)展出非常高效的合成方法。針對上述問題,本論文發(fā)展了一個由三個砌塊組成的基于連續(xù)區(qū)域選擇性糖苷化的一鍋法合成策略,開展了以下工作：(1)合理設(shè)計并高效合成了三個甘露糖砌塊；(2)從三個砌塊出發(fā),采用分步法優(yōu)化了兩步區(qū)域選擇性糖苷化合成全保護Man5的條件；(3)基于分步法確定的糖苷化反應(yīng)條件,以相同的三個砌塊采用一鍋法以61%的總收率合成了Man5,且該收率遠高于上述分步法38%的總收率。3總結(jié)和創(chuàng)新點本論文解決了兩類生物活性寡糖特別是Core M1 O-甘露聚糖的大量獲得性問題,為具有類似結(jié)構(gòu)的寡糖分子的合成提供了新的思路,也為后續(xù)相關(guān)生物學(xué)研究及未來相應(yīng)疾病的診斷治療奠定了基礎(chǔ)。主要創(chuàng)新點如下：(1)首次發(fā)展了一個基于丁二酮、叔丁基二甲基硅基和兩步高效的化學(xué)糖苷化反應(yīng)的Core M1 0-甘露二糖絲氨酸砌塊化學(xué)合成策略；(2)首次發(fā)展了一個基于細菌來源“一鍋多酶”糖苷化體系的多樣化導(dǎo)向的Core M1 0-甘露聚糖化學(xué)酶法合成策略；(3)首次實現(xiàn)了6個Core M1 O-甘露聚糖的大量、高效化學(xué)酶法合成；(4)首次實現(xiàn)了含有sLNGc、Lex、sLex單元的Core M1 O-甘露四糖和五糖結(jié)構(gòu)的全合成；(5)首次發(fā)展了一個一鍋法化學(xué)合成策略,完成了1個非對稱3,6-分支甘露戊糖(Man5)的高效化學(xué)法合成；(6)本論文中涉及的44個糖砌塊中24個為首次合成的新化合物,其中3個具有全新的糖鏈骨架結(jié)構(gòu)。
【關(guān)鍵詞】：化學(xué)酶法合成 肌營養(yǎng)不良相關(guān)蛋白聚糖 O-甘露聚糖 一鍋多酶 唾液酸化 巖藻糖化 甘露戊糖
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R914
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-16
• 縮略語說明16-18
• 第一章 前言18-46
• 1 引言18-23
• 1.1 細胞表面的糖鏈18-21
• 1.2 化學(xué)糖生物學(xué)21-23
• 2 寡糖合成研究進展23-42
• 2.1 寡糖的化學(xué)法合成23-37
• 2.2 寡糖的酶法合成37-39
• 2.3 寡糖的化學(xué)酶法合成39-41
• 2.4 寡糖合成中存在的問題41-42
• 3 糖鏈在化學(xué)糖生物學(xué)中的應(yīng)用42-44
• 4 本論文的研究內(nèi)容和擬解決的問題44-46
• 第二章 Core M1 O-甘露聚糖的化學(xué)酶法合成46-84
• 1 O-甘露聚糖的研究進展46-52
• 1.1 肌營養(yǎng)不良相關(guān)蛋白聚糖46-48
• 1.2 O-甘露聚糖的結(jié)構(gòu)和生物合成途徑48-50
• 1.3 O-甘露聚糖的研究趨勢50-52
• 2 O-甘露聚糖的合成進展及存在的問題52-53
• 2.1 O-甘露聚糖的合成進展52-53
• 2.2 O-甘露聚糖合成中存在的問題53
• 3 課題設(shè)計53-61
• 3.1 課題的提出53-58
• 3.2 逆合成分析58-61
• 4 Core M1 O-甘露聚糖的化學(xué)酶法合成61-80
• 4.1 Core M1 O-甘露二糖絲氨酸1的化學(xué)法合成61-68
• 4.2 Core M1 O-甘露三糖絲氨酸2的酶法合成68-70
• 4.3 Core M1 O-甘露四糖絲氨酸3,4的酶法合成70-75
• 4.4 Core M1 O-甘露寡糖絲氨酸5,6的酶法合成75-80
• 5 本章小結(jié)80-84
• 第三章 甘露戊糖的化學(xué)合成84-118
• 1 甘露戊糖研究進展84-86
• 1.1 N-聚糖(N-glycans)的結(jié)構(gòu)分類84-85
• 1.2 甘露戊糖(Man5)的結(jié)構(gòu)和功能85-86
• 2 甘露戊糖的合成進展及存在的問題86-89
• 3 課題設(shè)計89-92
• 4 甘露戊糖的化學(xué)合成92-116
• 4.1 單糖給體砌塊24的合成92-94
• 4.2 單糖受體砌塊25的合成94-99
• 4.3 三糖給體砌塊26的合成99-107
• 4.4 甘露戊糖44的分步法合成107-113
• 4.5 甘露戊糖44的“一鍋法”合成113-115
• 4.6五糖砌塊44的脫保護115-116
• 5 本章小結(jié)116-118
• 第四章 全文總結(jié)與展望118-123
• 1 全文總結(jié)118-121
• 2 創(chuàng)新點121-122
• 3 本論文的不足之處122
• 4 展望122-123
• 第五章 實驗部分123-148
• 1 一般方法123
• 2 酶的表達和純化123-126
• 3 化學(xué)與酶法合成126-148
• 參考文獻148-155
• 附錄一：重要化合物NMR圖譜155-207
• 附錄二：攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文207-208
• Article 1208-214
• Article 2214-220
• 致謝220-221
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表221

  本文關(guān)鍵詞：O-甘露聚糖和甘露戊糖的高效合成研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：254171