本文關鍵詞：O-甘露聚糖和甘露戊糖的高效合成研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細胞表面結構復雜的糖鏈在生物體內多種生理和病理過程中扮演著重要角色。然而,由于自然界中糖結構的復雜性很難通過天然提取分離的手段獲得足夠量、高純度的生物活性寡糖及其綴合物,因而糖鏈樣品的來源成為制約糖結構和功能研究的一大瓶頸。而采用化學法和酶法進行體外寡糖合成則為糖鏈的獲得提供了嶄新的途徑,是近年來糖科學研究的難點、熱點和前沿領域。本論文以解決兩類生物活性寡糖的來源性問題為目標,主要完成了兩部分工作：1.完成了6個Core M1 O-甘露聚糖(O-mannose glycans)分子的化學酶法合成；2.完成了1個非對稱3,6-分支甘露戊糖(Man5)的化學合成。1 Core Ml O-甘露聚糖的化學酶法合成O-甘露聚糖因其豐富的結構多樣性和重要的生物學功能已成為近年來糖生物學研究的新熱點和前沿領域。肌營養(yǎng)不良相關蛋白聚糖(a-dystroglycan, a-DG)表面的O-甘露聚糖能夠與肌細胞外基質分子相結合以維持抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復合物(dystrophin-glycoprotein complex, DGC)的正常結構和功能。因糖鏈生物合成途徑異常而造成的α-DG表面O-甘露聚糖低表達,會引起各種類型先天性肌營養(yǎng)不良(congenital muscular dystrophies, CMDs)。此外,O-甘露聚糖還與腫瘤細胞轉移和某些病毒對宿主細胞的入侵有密切關系。然而目前,O-甘露聚糖的生物合成途徑及其與細胞外基質分子間相互作用的構效關系尚不十分清楚。要解決這些問題,首先就要獲得足夠量高純度的O-甘露聚糖分子探針,結合糖的微陣列技術以發(fā)現(xiàn)生物合成途徑中的相關酶類并揭示其催化機制,并在分子水平上深入研究這些糖鏈與細胞外基質分子間相互作用的機制。然而,由于立體選擇性構建O-甘露聚糖結構中的唾液酸和巖藻糖糖苷鍵的挑戰(zhàn)性,加之O-甘露聚糖結構的高度多樣性,O-甘露聚糖的合成研究還遠遠落后于其生物活性研究：(1)已發(fā)展的策略均以某一個糖鏈結構為目標分子,且僅實現(xiàn)了O-甘露聚糖中2個結構(一個Core M1四糖和一個Core M3三糖)的合成;(2)已發(fā)展的化學合成策略存在路線冗長、糖苷化反應選擇性低、工作量大而總收率低等多種弊端,已報道的酶法合成也多受限于所采用的哺乳動物酶的催化效率低、可溶性表達量低、底物適應性差等缺陷；(3)對于Core M1系列中更為復雜的含有N-羥乙酰神經(jīng)氨酸化的N-乙酰乳糖胺(sLNGc)、路易斯X (Lewis x,Lex)和唾液酸化路易斯X(sialyl Lewis x, sLex)單元的四糖和五糖分子則尚未實現(xiàn)任何形式的合成。因此,急需發(fā)展一種能夠覆蓋盡可能多的該系列寡糖結構的多樣化導向的高效合成策略。針對上述問題,本論文發(fā)展了一個多樣化導向的基于連續(xù)“一鍋多酶”(one-pot multi-enzyme, OPME)糖苷化的Core M1 O-甘露聚糖化學酶法合成策略,主要開展了以下幾方面工作：(1) Core M1 O-甘露二糖氨基酸的化學法合成采用基于丁二酮、叔丁基二甲基硅基的保護基策略和兩步高效的化學糖苷化反應,靈活高效地合成了末端連有絲氨酸的Core M1 O-甘露聚糖核心二糖。(2) Core M1 O-甘露聚糖糖鏈的酶法延伸以化學合成的Core M1 O-甘露二糖絲氨酸為起始底物,將三個細菌來源的分別用于β1-4半乳糖苷鍵、α2-3唾液酸糖苷鍵、α1-3巖藻糖苷鍵構建的“一鍋多酶”糖苷化體系用于Core M1 O-甘露聚糖糖鏈的仿生化延伸,并合理調整酶催化反應順序,實現(xiàn)了Core M1 O-甘露聚糖分子的多樣化合成。最終以每步酶反應70%以上的收率首次實現(xiàn)了6個末端連有絲氨酸的CoreM1 O-甘露聚糖的高效、大量合成,其中包括含有sLNGc、Lex、sLex單元的復雜Core M1 O-甘露四糖和五糖的首次全合成。2非對稱3,6-分支甘露戊糖(Man5)的化學合成Man5是寡聚甘露糖和復雜型N-聚糖所共有的核心結構,也是HIV-1包膜糖蛋白gp120表面糖鏈中含量最為豐富的結構。大量證據(jù)表明,Man5結構域是HIV人單克隆抗體2G12的識別位點,也是可與HIV包膜結合的凝集素cyanovirin-N (CVN)的最初結合靶點。因而以Man5為基礎構建成簇抗原表位是抗HIV糖疫苗研究的熱點,且gp120寡聚甘露糖與受體相互作用的研究也需要大量高純度Man5樣品。然而,目前寡聚甘露糖的制備多采用化學合成,且多集中在線性結構和對稱的分支結構上,對此非對稱分支Man5尚未發(fā)展出非常高效的合成方法。針對上述問題,本論文發(fā)展了一個由三個砌塊組成的基于連續(xù)區(qū)域選擇性糖苷化的一鍋法合成策略,開展了以下工作：(1)合理設計并高效合成了三個甘露糖砌塊；(2)從三個砌塊出發(fā),采用分步法優(yōu)化了兩步區(qū)域選擇性糖苷化合成全保護Man5的條件；(3)基于分步法確定的糖苷化反應條件,以相同的三個砌塊采用一鍋法以61%的總收率合成了Man5,且該收率遠高于上述分步法38%的總收率。3總結和創(chuàng)新點本論文解決了兩類生物活性寡糖特別是Core M1 O-甘露聚糖的大量獲得性問題,為具有類似結構的寡糖分子的合成提供了新的思路,也為后續(xù)相關生物學研究及未來相應疾病的診斷治療奠定了基礎。主要創(chuàng)新點如下：(1)首次發(fā)展了一個基于丁二酮、叔丁基二甲基硅基和兩步高效的化學糖苷化反應的Core M1 0-甘露二糖絲氨酸砌塊化學合成策略；(2)首次發(fā)展了一個基于細菌來源“一鍋多酶”糖苷化體系的多樣化導向的Core M1 0-甘露聚糖化學酶法合成策略；(3)首次實現(xiàn)了6個Core M1 O-甘露聚糖的大量、高效化學酶法合成；(4)首次實現(xiàn)了含有sLNGc、Lex、sLex單元的Core M1 O-甘露四糖和五糖結構的全合成；(5)首次發(fā)展了一個一鍋法化學合成策略,完成了1個非對稱3,6-分支甘露戊糖(Man5)的高效化學法合成；(6)本論文中涉及的44個糖砌塊中24個為首次合成的新化合物,其中3個具有全新的糖鏈骨架結構。
【關鍵詞】：化學酶法合成 肌營養(yǎng)不良相關蛋白聚糖 O-甘露聚糖 一鍋多酶 唾液酸化 巖藻糖化 甘露戊糖
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R914
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-16
• 縮略語說明16-18
• 第一章 前言18-46
• 1 引言18-23
• 1.1 細胞表面的糖鏈18-21
• 1.2 化學糖生物學21-23
• 2 寡糖合成研究進展23-42
• 2.1 寡糖的化學法合成23-37
• 2.2 寡糖的酶法合成37-39
• 2.3 寡糖的化學酶法合成39-41
• 2.4 寡糖合成中存在的問題41-42
• 3 糖鏈在化學糖生物學中的應用42-44
• 4 本論文的研究內容和擬解決的問題44-46
• 第二章 Core M1 O-甘露聚糖的化學酶法合成46-84
• 1 O-甘露聚糖的研究進展46-52
• 1.1 肌營養(yǎng)不良相關蛋白聚糖46-48
• 1.2 O-甘露聚糖的結構和生物合成途徑48-50
• 1.3 O-甘露聚糖的研究趨勢50-52
• 2 O-甘露聚糖的合成進展及存在的問題52-53
• 2.1 O-甘露聚糖的合成進展52-53
• 2.2 O-甘露聚糖合成中存在的問題53
• 3 課題設計53-61
• 3.1 課題的提出53-58
• 3.2 逆合成分析58-61
• 4 Core M1 O-甘露聚糖的化學酶法合成61-80
• 4.1 Core M1 O-甘露二糖絲氨酸1的化學法合成61-68
• 4.2 Core M1 O-甘露三糖絲氨酸2的酶法合成68-70
• 4.3 Core M1 O-甘露四糖絲氨酸3,4的酶法合成70-75
• 4.4 Core M1 O-甘露寡糖絲氨酸5,6的酶法合成75-80
• 5 本章小結80-84
• 第三章 甘露戊糖的化學合成84-118
• 1 甘露戊糖研究進展84-86
• 1.1 N-聚糖(N-glycans)的結構分類84-85
• 1.2 甘露戊糖(Man5)的結構和功能85-86
• 2 甘露戊糖的合成進展及存在的問題86-89
• 3 課題設計89-92
• 4 甘露戊糖的化學合成92-116
• 4.1 單糖給體砌塊24的合成92-94
• 4.2 單糖受體砌塊25的合成94-99
• 4.3 三糖給體砌塊26的合成99-107
• 4.4 甘露戊糖44的分步法合成107-113
• 4.5 甘露戊糖44的“一鍋法”合成113-115
• 4.6五糖砌塊44的脫保護115-116
• 5 本章小結116-118
• 第四章 全文總結與展望118-123
• 1 全文總結118-121
• 2 創(chuàng)新點121-122
• 3 本論文的不足之處122
• 4 展望122-123
• 第五章 實驗部分123-148
• 1 一般方法123
• 2 酶的表達和純化123-126
• 3 化學與酶法合成126-148
• 參考文獻148-155
• 附錄一：重要化合物NMR圖譜155-207
• 附錄二：攻讀學位期間發(fā)表的學術論文207-208
• Article 1208-214
• Article 2214-220
• 致謝220-221
• 學位論文評閱及答辯情況表221

  本文關鍵詞：O-甘露聚糖和甘露戊糖的高效合成研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：254171