本文關(guān)鍵詞：miR-145在漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一,且是公認(rèn)病死率最高的婦科惡性腫瘤。漿液性卵巢癌(serous ovarian carcinoma, SOC)是其中最常見(jiàn)和惡性程度最高的亞型,五年生存率僅30%,究其原因是缺乏有效的早期診斷策略以及化療耐藥所導(dǎo)致的復(fù)發(fā)。70%的漿液性卵巢癌患者在就診時(shí)已是晚期。70%的患者又在手術(shù)和化療后復(fù)發(fā)。漿液性卵巢癌包括高級(jí)別和低級(jí)別兩種,最新的研究觀點(diǎn)認(rèn)為二者均起源于輸卵管上皮細(xì)胞。而漿液性卵巢癌同時(shí)是一個(gè)基因病,研究發(fā)現(xiàn)漿液性卵巢癌,尤其是高級(jí)別漿液性卵巢癌是DNA不穩(wěn)定腫瘤,96%的患者有TP53突變,并在此基礎(chǔ)上伴有一系列原癌基因激活,抑癌基因失活及信號(hào)通路異常。盡管如此,漿液性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并不十分明確,可預(yù)測(cè)其治療效果及預(yù)后等的分子標(biāo)記物仍然十分有限。發(fā)現(xiàn)漿液性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵基因和調(diào)節(jié)通路是漿液性卵巢癌研究重點(diǎn),將會(huì)有利于早期診斷和有效治療,從而降低其病死率。microRNA (miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)來(lái)源于內(nèi)源性染色體上的非編碼RNA,平均長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。它們基于與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(un-translational region, UTR)序列互補(bǔ),能夠通過(guò)與靶mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì),引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯,從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控。根據(jù)其所調(diào)控的靶基因的功能不同,miRNA可扮演原癌基因或抑癌基因的角色,在惡性腫瘤發(fā)生以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。有報(bào)道一部分miRNA可以為p53調(diào)控表達(dá),更奠定了其在惡性腫瘤中的重要地位。miR-145是可以被p53調(diào)控的miRNA之一。研究人員發(fā)現(xiàn)miR-145在多種人類(lèi)惡性腫瘤中通過(guò)調(diào)控不同的靶基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。但miR-145異常表達(dá)在漿液性卵巢癌中的作用尚不明確,其發(fā)揮作用的上下游機(jī)制更是有待進(jìn)一步研究。因此本課題主要致力于研究miR-145在漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中作用以及具體機(jī)制,研究?jī)?nèi)容分為以下三部分。一.miR-145在漿液性卵巢癌中的異常表達(dá)及對(duì)增殖轉(zhuǎn)移能力的影響；二.miR-145在漿液性卵巢癌中發(fā)揮作用的關(guān)鍵下游靶基因的鑒定；三.miR-145在漿液性卵巢癌中異常表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制。第一部分miR-145在漿液性卵巢癌中的異常表達(dá)及對(duì)增殖轉(zhuǎn)移能力的影響目的：已有研究表明miR-145在多種惡性腫瘤中異常低表達(dá),包括乳腺癌,胃癌及膀胱癌等,且miR-145可以抑制瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,從而起到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。但miR-145在漿液性卵巢癌中具體起到什么作用,目前為止尚不完全明確。本研究首先通過(guò)檢測(cè)漿液性卵巢癌組織標(biāo)本及細(xì)胞系中miR-145的表達(dá)初步確立其角色,再通過(guò)調(diào)控細(xì)胞系中miR-145的表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力的影響。方法：收集漿液性卵巢癌組織和對(duì)照輸卵管組織各5例并提取RNA,行miRNA芯片檢測(cè),觀察miR-145在差異表達(dá)miRNA中所占地位。擴(kuò)大樣本量采用qPCR方法檢測(cè)漿液性卵巢癌組織和對(duì)照組織中miR-145的表達(dá)差異,以及卵巢癌細(xì)胞系和正常對(duì)照細(xì)胞系中miR-145的表達(dá)水平。選取三種卵巢癌細(xì)胞系(SKOV3,A2780和HEY),通過(guò)慢病毒感染的方式上調(diào)miR-145的表達(dá)。然后體外行MTT法測(cè)定生長(zhǎng)曲線,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定克隆形成能力,以檢測(cè)細(xì)胞系增殖能力的改變。計(jì)數(shù)并比較Transwell小室實(shí)驗(yàn)中穿壁細(xì)胞的數(shù)目來(lái)檢測(cè)調(diào)控miR-145表達(dá)后細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用裸鼠皮下移植瘤以及尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型。皮下移植瘤模型中,統(tǒng)計(jì)miR-145過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組的腫瘤大小和重量,以比較成瘤能力的差異。尾靜脈注射模型中,統(tǒng)計(jì)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的多少來(lái)判定肺轉(zhuǎn)移能力的差別。結(jié)果：miRNA芯片結(jié)果顯示,與對(duì)照輸卵管組織相比,miR-145在漿液性卵巢癌組織中表達(dá)明顯降低,且是表達(dá)差異最明顯的miRNA。QPCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-145在漿液性卵巢癌(包括48例高級(jí)別和20例低級(jí)別)的表達(dá)低于在對(duì)照組織(n=19)的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在6種卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)也均低于在正常對(duì)照細(xì)胞的表達(dá)。三種細(xì)胞系在過(guò)表達(dá)miR-145后,其體外增殖能力降低,侵襲遷移能力下降,裸鼠體內(nèi)成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力也下降。結(jié)論：miR-145在漿液性卵巢癌中扮演抑癌基因的角色,其高表達(dá)能降低卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力。第二部分miR-145在漿液性卵巢癌中發(fā)揮作用的關(guān)鍵下游靶基因的鑒定目的：miRNA發(fā)揮作用的機(jī)制是通過(guò)與靶基因的mRNA結(jié)合進(jìn)而降解或者抑制其翻譯。已有報(bào)導(dǎo)miR-145在不同腫瘤中可與不同的下游基因結(jié)合并調(diào)控表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤惡性行為的作用。本研究旨在闡明在漿液性卵巢癌中與miR-145直接結(jié)合并受其調(diào)控的靶基因,以及該靶基因是否可以影響卵巢癌細(xì)胞的惡性行為。方法：綜合預(yù)測(cè)軟件targetscan與課題組此前做過(guò)的漿液性卵巢癌的蛋白組學(xué)芯片,篩選出候選基因metadherin (MTDH). Western blot檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞系和正常對(duì)照細(xì)胞系中MTDH表達(dá)差異,同時(shí)提取卵巢漿液性癌組織以及正常對(duì)照組織的蛋白,檢測(cè)MTDH在兩種組織中表達(dá)差異。進(jìn)一步檢測(cè)三種卵巢癌細(xì)胞系上調(diào)以及下調(diào)miR-145后,細(xì)胞中MTDH蛋白水平的變化。同時(shí)分析比較卵巢癌細(xì)胞系和輸卵管上皮細(xì)胞中MTDH和miR-145基礎(chǔ)表達(dá)水平的相關(guān)性。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MTDH是否miR-145的直接下游靶基因。為確認(rèn)MTDH作為miR-145下游功能性的直接靶點(diǎn)影響卵巢癌細(xì)胞惡性行為,采用rescue實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MTDH的過(guò)表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)miR-145對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制。Western blot檢測(cè)間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的變化以確認(rèn)miR-145與MTDH的相互作用對(duì)下游通路和細(xì)胞惡性行為的影響。免疫組化檢測(cè)具有隨訪資料的漿液性卵巢癌患者的MTDH表達(dá),并通過(guò)生存曲線分析MTDH表達(dá)水平與漿液性卵巢癌病人預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：MTDH是原癌基因,在課題組之前的蛋白組學(xué)芯片中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在漿液性卵巢癌中高表達(dá)。軟件預(yù)測(cè)顯示MTDH mRNA 3'UTR和miR-145有兩處可以結(jié)合的保守序列。MTDH蛋白在6種卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)均高于在對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)。漿液性卵巢癌組織(包括48例高級(jí)別和26例低級(jí)別)中MTDH蛋白表達(dá)高于正常對(duì)照組織(n=13)。且在miR-145上調(diào)的細(xì)胞系中,MTDH蛋白水平明顯下降；相反,miR-145下調(diào)細(xì)胞系中則MTDH蛋白表達(dá)上升。而綜合分析6種卵巢癌細(xì)胞和1種輸卵管上皮細(xì)胞中miR-145和MTDH表達(dá),發(fā)現(xiàn)二者呈負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中,miR-145可以降低構(gòu)建的MTDH 3'UTR野生載體而非突變載體的熒光活性。Rescue實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在miR-145穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中轉(zhuǎn)入MTDH后,降低的細(xì)胞增殖,遷移和侵襲能力重新恢復(fù)。Western blot結(jié)果提示在miR-145轉(zhuǎn)染細(xì)胞中,除MTDH下降外,上皮分子(E-cadherin)表達(dá)上升,而間質(zhì)分子(N-cadherin, Vimentin, Fibronectin和ZEB-1)表達(dá)下降。生存分析發(fā)現(xiàn)MTDH高表達(dá)的漿液性卵巢癌患者預(yù)后更差,具體表現(xiàn)為總生存期的縮短。結(jié)論：漿液性卵巢癌中MTDH是miR-145的直接和功能性的下游靶基因,miR-145對(duì)MTDH的負(fù)性調(diào)控影響漿液性卵巢癌的惡性行為和病人預(yù)后。第三部分miR-145在漿液性卵巢癌中異常表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制目的：許多miRNA可以為p53調(diào)控,已有報(bào)導(dǎo)miR-145的表達(dá)受野生p53的直接正性調(diào)控�；诖蟛糠譂{液性卵巢癌尤其是高級(jí)別漿液性卵巢癌存在TP53突變,我們推測(cè)在TP53正常的漿液性卵巢癌中,上游野生p53誘導(dǎo)miR-145上升并進(jìn)而抑制下游MTDH發(fā)揮了抑制腫瘤進(jìn)展的功能,而在TP53突變的漿液性卵巢癌中,miR-145因缺少p53誘導(dǎo)而表現(xiàn)為異常低表達(dá)。TP53突變,miR-145低表達(dá),MTDH高表達(dá)可能為大部分漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的重要機(jī)制。因此本研究旨在通過(guò)體外誘導(dǎo)p53以及在漿液性卵巢癌組織樣本中進(jìn)行驗(yàn)證來(lái)確認(rèn)miR-145是否為野生p53誘導(dǎo)。方法：選取表達(dá)野生型p53的卵巢癌細(xì)胞系(A2780和HEY)以多柔比星(doxorubicin, DOX)藥物進(jìn)行誘導(dǎo)p53表達(dá)。QPCR和western blot分別檢驗(yàn)miR-145和MTDH及p53的表達(dá)改變。組織標(biāo)本實(shí)驗(yàn)中,以免疫組化檢測(cè)p53在漿液性卵巢癌中表達(dá)并分為野生p53組和突變p53組后,分析比較兩組中miR-145表達(dá)差異。綜合第一部分研究?jī)?nèi)容中miR-145在漿液性卵巢癌組織中表達(dá)水平,以及第二部分內(nèi)容中MTDH在漿液性卵巢癌組織中蛋白表達(dá)的western blot結(jié)果,分析二者之間的相關(guān)關(guān)系。再將第二部分中分析預(yù)后的MTDH免疫組化結(jié)果與此部分p53免疫組化結(jié)果比較,看兩者在漿液性卵巢癌中表達(dá)是否相關(guān)。結(jié)果：DOX處理卵巢癌細(xì)胞系后,野生p53明顯上升,并同時(shí)伴有miR-145的上升和MTDH的下降。漿液性卵巢癌野生p53組的miR-145表達(dá)高于突變p53組。miR-145和MTDH在漿液性卵巢癌組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。而免疫組化結(jié)果顯示突變p53和MTDH的表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論：漿液性卵巢癌中miR-145的異�？赡苡缮嫌蝡53異常所致。p53, miR-145和MTDH形成了一個(gè)線性調(diào)節(jié)通路影響漿液性卵巢癌的進(jìn)展。論文重點(diǎn)闡述了miR-145在漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中扮演的角色作用以及其發(fā)揮作用的上下游調(diào)節(jié)機(jī)制。創(chuàng)新之處主要表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)：1.對(duì)miR-145在漿液性卵巢癌中所發(fā)揮作用進(jìn)行了詳實(shí)完整的體外體內(nèi)和組織標(biāo)本學(xué)研究,其抑癌基因的角色得到全面證實(shí)；2.首次提出MTDH是miR-145的直接下游靶基因,MTDH受miR-145負(fù)調(diào)控影響漿液性卵巢癌的惡性行為和患者預(yù)后；3.對(duì)miR-145在漿液性卵巢癌中低表達(dá)的上游調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行研究,指出miR-145的異常表達(dá)可能為上游野生p53失活所致；4.首次闡述了p53-miR-145-MTDH的線性調(diào)控關(guān)系,并指明其是漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的重要調(diào)控機(jī)制。本論文尚存在不足之處,也將會(huì)是我們未來(lái)的研究方向。主要表現(xiàn)為：1.論文對(duì)漿液性卵巢癌增殖和轉(zhuǎn)移的能力進(jìn)行了研究,而化療藥物敏感性未有研究。漿液性卵巢癌患者化療耐藥和復(fù)發(fā)是其預(yù)后差的一大原因。p53-miR-145-MTDH調(diào)控軸是否影響漿液性卵巢癌化療敏感性,需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)藥敏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。2.論文提出p53是miR-145異常表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制。高級(jí)別漿液性卵巢癌患者存在高的TP53突變率,因此p53-miR-145-MTDH軸在高級(jí)別患者腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但是低級(jí)別漿液性卵巢癌中雖然同樣存在miR-145的低表達(dá),其TP53突變率低,因此,低級(jí)別患者中miR-145異常低表達(dá)可能有p53之外的上游調(diào)控機(jī)制,這一點(diǎn)也我們需要進(jìn)一步探索。3.課題研究中所使用的細(xì)胞系均較古老,有學(xué)者認(rèn)為有些細(xì)胞系不能證明是漿液性卵巢癌來(lái)源。因此構(gòu)建新的漿液性卵巢癌細(xì)胞系,尤其是針對(duì)高級(jí)別和低級(jí)別漿液性癌分別構(gòu)建對(duì)應(yīng)細(xì)胞系將會(huì)有重要意義。4.缺少漿液性卵巢癌對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,課題組目前正在構(gòu)建中的輸卵管特異性的p53突變轉(zhuǎn)基因小鼠模型,或許可以應(yīng)用到未來(lái)的研究中,并用來(lái)檢驗(yàn)論文提出的p53-miR-145-MTDH調(diào)控軸假說(shuō)。
【關(guān)鍵詞】：miR-145 漿液性卵巢癌 抑癌基因 增殖 轉(zhuǎn)移 miR-145 漿液性卵巢癌 靶基因 MTDH 預(yù)后 miR-145 漿液性卵巢癌 上游 p53 相關(guān)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-21
• 符號(hào)說(shuō)明21-23
• 前言23-25
• 第一部分25-46
• 前言25-26
• 材料與方法26-42
• 1.實(shí)驗(yàn)材料26-30
• 2.實(shí)驗(yàn)方法30-42
• 結(jié)果42-44
• 1.miRNA巧片顯示miR-145在SOC中低表達(dá)42-43
• 2. QPCR驗(yàn)證miRNA巧片的正確性43
• 3. QPCR檢驗(yàn)miR-145在大樣本SOC a及細(xì)胞系中的表達(dá)43
• 4.構(gòu)建過(guò)表達(dá)m化-145的卵巢癌細(xì)艙系43
• 5.過(guò)表達(dá)miR-145的細(xì)胞X椫襯芰Ω謀
  
  本文編號(hào)：253799
  boshi