本文關(guān)鍵詞：miR-145在漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一,且是公認病死率最高的婦科惡性腫瘤。漿液性卵巢癌(serous ovarian carcinoma, SOC)是其中最常見和惡性程度最高的亞型,五年生存率僅30%,究其原因是缺乏有效的早期診斷策略以及化療耐藥所導致的復(fù)發(fā)。70%的漿液性卵巢癌患者在就診時已是晚期。70%的患者又在手術(shù)和化療后復(fù)發(fā)。漿液性卵巢癌包括高級別和低級別兩種,最新的研究觀點認為二者均起源于輸卵管上皮細胞。而漿液性卵巢癌同時是一個基因病,研究發(fā)現(xiàn)漿液性卵巢癌,尤其是高級別漿液性卵巢癌是DNA不穩(wěn)定腫瘤,96%的患者有TP53突變,并在此基礎(chǔ)上伴有一系列原癌基因激活,抑癌基因失活及信號通路異常。盡管如此,漿液性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制并不十分明確,可預(yù)測其治療效果及預(yù)后等的分子標記物仍然十分有限。發(fā)現(xiàn)漿液性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因和調(diào)節(jié)通路是漿液性卵巢癌研究重點,將會有利于早期診斷和有效治療,從而降低其病死率。microRNA (miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類來源于內(nèi)源性染色體上的非編碼RNA,平均長度約為22個核苷酸。它們基于與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(un-translational region, UTR)序列互補,能夠通過與靶mRNA特異性的堿基互補配對,引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯,從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào)控。根據(jù)其所調(diào)控的靶基因的功能不同,miRNA可扮演原癌基因或抑癌基因的角色,在惡性腫瘤發(fā)生以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。有報道一部分miRNA可以為p53調(diào)控表達,更奠定了其在惡性腫瘤中的重要地位。miR-145是可以被p53調(diào)控的miRNA之一。研究人員發(fā)現(xiàn)miR-145在多種人類惡性腫瘤中通過調(diào)控不同的靶基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。但miR-145異常表達在漿液性卵巢癌中的作用尚不明確,其發(fā)揮作用的上下游機制更是有待進一步研究。因此本課題主要致力于研究miR-145在漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中作用以及具體機制,研究內(nèi)容分為以下三部分。一.miR-145在漿液性卵巢癌中的異常表達及對增殖轉(zhuǎn)移能力的影響；二.miR-145在漿液性卵巢癌中發(fā)揮作用的關(guān)鍵下游靶基因的鑒定；三.miR-145在漿液性卵巢癌中異常表達的上游調(diào)控機制。第一部分miR-145在漿液性卵巢癌中的異常表達及對增殖轉(zhuǎn)移能力的影響目的：已有研究表明miR-145在多種惡性腫瘤中異常低表達,包括乳腺癌,胃癌及膀胱癌等,且miR-145可以抑制瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,從而起到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。但miR-145在漿液性卵巢癌中具體起到什么作用,目前為止尚不完全明確。本研究首先通過檢測漿液性卵巢癌組織標本及細胞系中miR-145的表達初步確立其角色,再通過調(diào)控細胞系中miR-145的表達水平來進行體外和體內(nèi)實驗以檢測其對卵巢癌細胞增殖轉(zhuǎn)移能力的影響。方法：收集漿液性卵巢癌組織和對照輸卵管組織各5例并提取RNA,行miRNA芯片檢測,觀察miR-145在差異表達miRNA中所占地位。擴大樣本量采用qPCR方法檢測漿液性卵巢癌組織和對照組織中miR-145的表達差異,以及卵巢癌細胞系和正常對照細胞系中miR-145的表達水平。選取三種卵巢癌細胞系(SKOV3,A2780和HEY),通過慢病毒感染的方式上調(diào)miR-145的表達。然后體外行MTT法測定生長曲線,平板克隆形成實驗測定克隆形成能力,以檢測細胞系增殖能力的改變。計數(shù)并比較Transwell小室實驗中穿壁細胞的數(shù)目來檢測調(diào)控miR-145表達后細胞遷移和侵襲能力的改變。體內(nèi)實驗采用裸鼠皮下移植瘤以及尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型。皮下移植瘤模型中,統(tǒng)計miR-145過表達組和對照組的腫瘤大小和重量,以比較成瘤能力的差異。尾靜脈注射模型中,統(tǒng)計肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的多少來判定肺轉(zhuǎn)移能力的差別。結(jié)果：miRNA芯片結(jié)果顯示,與對照輸卵管組織相比,miR-145在漿液性卵巢癌組織中表達明顯降低,且是表達差異最明顯的miRNA。QPCR驗證實驗結(jié)果表明,miR-145在漿液性卵巢癌(包括48例高級別和20例低級別)的表達低于在對照組織(n=19)的表達,差異有統(tǒng)計學意義,在6種卵巢癌細胞系中的表達也均低于在正常對照細胞的表達。三種細胞系在過表達miR-145后,其體外增殖能力降低,侵襲遷移能力下降,裸鼠體內(nèi)成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力也下降。結(jié)論：miR-145在漿液性卵巢癌中扮演抑癌基因的角色,其高表達能降低卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力。第二部分miR-145在漿液性卵巢癌中發(fā)揮作用的關(guān)鍵下游靶基因的鑒定目的：miRNA發(fā)揮作用的機制是通過與靶基因的mRNA結(jié)合進而降解或者抑制其翻譯。已有報導miR-145在不同腫瘤中可與不同的下游基因結(jié)合并調(diào)控表達,進而發(fā)揮抑制腫瘤惡性行為的作用。本研究旨在闡明在漿液性卵巢癌中與miR-145直接結(jié)合并受其調(diào)控的靶基因,以及該靶基因是否可以影響卵巢癌細胞的惡性行為。方法：綜合預(yù)測軟件targetscan與課題組此前做過的漿液性卵巢癌的蛋白組學芯片,篩選出候選基因metadherin (MTDH). Western blot檢測卵巢癌細胞系和正常對照細胞系中MTDH表達差異,同時提取卵巢漿液性癌組織以及正常對照組織的蛋白,檢測MTDH在兩種組織中表達差異。進一步檢測三種卵巢癌細胞系上調(diào)以及下調(diào)miR-145后,細胞中MTDH蛋白水平的變化。同時分析比較卵巢癌細胞系和輸卵管上皮細胞中MTDH和miR-145基礎(chǔ)表達水平的相關(guān)性。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CMTDH是否miR-145的直接下游靶基因。為確認MTDH作為miR-145下游功能性的直接靶點影響卵巢癌細胞惡性行為,采用rescue實驗檢測MTDH的過表達是否可以逆轉(zhuǎn)miR-145對卵巢癌細胞的抑制。Western blot檢測間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的變化以確認miR-145與MTDH的相互作用對下游通路和細胞惡性行為的影響。免疫組化檢測具有隨訪資料的漿液性卵巢癌患者的MTDH表達,并通過生存曲線分析MTDH表達水平與漿液性卵巢癌病人預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：MTDH是原癌基因,在課題組之前的蛋白組學芯片中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在漿液性卵巢癌中高表達。軟件預(yù)測顯示MTDH mRNA 3'UTR和miR-145有兩處可以結(jié)合的保守序列。MTDH蛋白在6種卵巢癌細胞系中表達均高于在對照細胞中的表達。漿液性卵巢癌組織(包括48例高級別和26例低級別)中MTDH蛋白表達高于正常對照組織(n=13)。且在miR-145上調(diào)的細胞系中,MTDH蛋白水平明顯下降；相反,miR-145下調(diào)細胞系中則MTDH蛋白表達上升。而綜合分析6種卵巢癌細胞和1種輸卵管上皮細胞中miR-145和MTDH表達,發(fā)現(xiàn)二者呈負相關(guān)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炛?miR-145可以降低構(gòu)建的MTDH 3'UTR野生載體而非突變載體的熒光活性。Rescue實驗結(jié)果顯示,在miR-145穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中轉(zhuǎn)入MTDH后,降低的細胞增殖,遷移和侵襲能力重新恢復(fù)。Western blot結(jié)果提示在miR-145轉(zhuǎn)染細胞中,除MTDH下降外,上皮分子(E-cadherin)表達上升,而間質(zhì)分子(N-cadherin, Vimentin, Fibronectin和ZEB-1)表達下降。生存分析發(fā)現(xiàn)MTDH高表達的漿液性卵巢癌患者預(yù)后更差,具體表現(xiàn)為總生存期的縮短。結(jié)論：漿液性卵巢癌中MTDH是miR-145的直接和功能性的下游靶基因,miR-145對MTDH的負性調(diào)控影響漿液性卵巢癌的惡性行為和病人預(yù)后。第三部分miR-145在漿液性卵巢癌中異常表達的上游調(diào)控機制目的：許多miRNA可以為p53調(diào)控,已有報導miR-145的表達受野生p53的直接正性調(diào)控�；诖蟛糠譂{液性卵巢癌尤其是高級別漿液性卵巢癌存在TP53突變,我們推測在TP53正常的漿液性卵巢癌中,上游野生p53誘導miR-145上升并進而抑制下游MTDH發(fā)揮了抑制腫瘤進展的功能,而在TP53突變的漿液性卵巢癌中,miR-145因缺少p53誘導而表現(xiàn)為異常低表達。TP53突變,miR-145低表達,MTDH高表達可能為大部分漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的重要機制。因此本研究旨在通過體外誘導p53以及在漿液性卵巢癌組織樣本中進行驗證來確認miR-145是否為野生p53誘導。方法：選取表達野生型p53的卵巢癌細胞系(A2780和HEY)以多柔比星(doxorubicin, DOX)藥物進行誘導p53表達。QPCR和western blot分別檢驗miR-145和MTDH及p53的表達改變。組織標本實驗中,以免疫組化檢測p53在漿液性卵巢癌中表達并分為野生p53組和突變p53組后,分析比較兩組中miR-145表達差異。綜合第一部分研究內(nèi)容中miR-145在漿液性卵巢癌組織中表達水平,以及第二部分內(nèi)容中MTDH在漿液性卵巢癌組織中蛋白表達的western blot結(jié)果,分析二者之間的相關(guān)關(guān)系。再將第二部分中分析預(yù)后的MTDH免疫組化結(jié)果與此部分p53免疫組化結(jié)果比較,看兩者在漿液性卵巢癌中表達是否相關(guān)。結(jié)果：DOX處理卵巢癌細胞系后,野生p53明顯上升,并同時伴有miR-145的上升和MTDH的下降。漿液性卵巢癌野生p53組的miR-145表達高于突變p53組。miR-145和MTDH在漿液性卵巢癌組織中表達呈負相關(guān)。而免疫組化結(jié)果顯示突變p53和MTDH的表達呈正相關(guān)。結(jié)論：漿液性卵巢癌中miR-145的異�？赡苡缮嫌蝡53異常所致。p53, miR-145和MTDH形成了一個線性調(diào)節(jié)通路影響漿液性卵巢癌的進展。論文重點闡述了miR-145在漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中扮演的角色作用以及其發(fā)揮作用的上下游調(diào)節(jié)機制。創(chuàng)新之處主要表現(xiàn)為以下幾點：1.對miR-145在漿液性卵巢癌中所發(fā)揮作用進行了詳實完整的體外體內(nèi)和組織標本學研究,其抑癌基因的角色得到全面證實；2.首次提出MTDH是miR-145的直接下游靶基因,MTDH受miR-145負調(diào)控影響漿液性卵巢癌的惡性行為和患者預(yù)后；3.對miR-145在漿液性卵巢癌中低表達的上游調(diào)節(jié)機制進行研究,指出miR-145的異常表達可能為上游野生p53失活所致；4.首次闡述了p53-miR-145-MTDH的線性調(diào)控關(guān)系,并指明其是漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的重要調(diào)控機制。本論文尚存在不足之處,也將會是我們未來的研究方向。主要表現(xiàn)為：1.論文對漿液性卵巢癌增殖和轉(zhuǎn)移的能力進行了研究,而化療藥物敏感性未有研究。漿液性卵巢癌患者化療耐藥和復(fù)發(fā)是其預(yù)后差的一大原因。p53-miR-145-MTDH調(diào)控軸是否影響漿液性卵巢癌化療敏感性,需要進一步設(shè)計藥敏實驗驗證。2.論文提出p53是miR-145異常表達的上游調(diào)控機制。高級別漿液性卵巢癌患者存在高的TP53突變率,因此p53-miR-145-MTDH軸在高級別患者腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但是低級別漿液性卵巢癌中雖然同樣存在miR-145的低表達,其TP53突變率低,因此,低級別患者中miR-145異常低表達可能有p53之外的上游調(diào)控機制,這一點也我們需要進一步探索。3.課題研究中所使用的細胞系均較古老,有學者認為有些細胞系不能證明是漿液性卵巢癌來源。因此構(gòu)建新的漿液性卵巢癌細胞系,尤其是針對高級別和低級別漿液性癌分別構(gòu)建對應(yīng)細胞系將會有重要意義。4.缺少漿液性卵巢癌對應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,課題組目前正在構(gòu)建中的輸卵管特異性的p53突變轉(zhuǎn)基因小鼠模型,或許可以應(yīng)用到未來的研究中,并用來檢驗論文提出的p53-miR-145-MTDH調(diào)控軸假說。
【關(guān)鍵詞】：miR-145 漿液性卵巢癌 抑癌基因 增殖 轉(zhuǎn)移 miR-145 漿液性卵巢癌 靶基因 MTDH 預(yù)后 miR-145 漿液性卵巢癌 上游 p53 相關(guān)
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-21
• 符號說明21-23
• 前言23-25
• 第一部分25-46
• 前言25-26
• 材料與方法26-42
• 1.實驗材料26-30
• 2.實驗方法30-42
• 結(jié)果42-44
• 1.miRNA巧片顯示miR-145在SOC中低表達42-43
• 2. QPCR驗證miRNA巧片的正確性43
• 3. QPCR檢驗miR-145在大樣本SOC a及細胞系中的表達43
• 4.構(gòu)建過表達m化-145的卵巢癌細艙系43
• 5.過表達miR-145的細胞X椫襯芰Ω謀
  
  本文編號：253799
  boshi