【摘要】：目的:炎癥性腸病是一種腸道的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病,主要包含克羅恩病(Crohn' s Disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC),主要癥狀為腹痛、腹瀉、黏液便及膿血便,大約一半的嚴重病例需要手術(shù)治,并且常常伴隨嚴重的并發(fā)癥,持續(xù)的慢性炎癥還可以增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風險,嚴重影響患者生活質(zhì)量,并且,有研究表明,結(jié)直腸癌的發(fā)病風險與腸道炎癥的嚴重程度和持續(xù)時間成正相關(guān)。黃連在治療胃腸道炎癥方面有著突出的優(yōu)勢,無論是結(jié)腸炎還是結(jié)腸癌均有一定的療效,但是黃連為苦寒之品,長期服用會帶來一些不良反應(yīng)。"黃連-干姜"藥對在中醫(yī)臨床上體現(xiàn)了寒溫并用的思想,是導(dǎo)師在臨床常用的一種配伍,能夠緩解長期應(yīng)用苦寒藥治療慢性疾病帶來的一系列不良反應(yīng)。本研究采用DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型、巨噬細胞RAW264.7細胞和結(jié)腸癌細胞系HT29、HCT116作為研究對象,探討"黃連-干姜"藥對預(yù)防結(jié)腸炎的作用及機制,以及其對結(jié)腸癌細胞的促凋亡作用及機制。方法:1."黃連-干姜"藥對主要化學(xué)成分的研究按1:1比例稱取干姜、黃連共400g,加8倍量水,冷浸1h,微沸回流1h,傾出藥液,再加7倍量水,微沸回流30min,傾出藥液,合并兩次的藥液,濾紙過濾,減壓濃縮,冷凍干燥,稱量凍干粉重量為31.8g,備用。稱取1g上述全方藥凍干粉,加ddH20 20.96 M1,離心(14000 rpmx30 min),取上清液,即得含有0.6g/ml原藥的溶液。根據(jù)文獻,組建黃連和干姜兩味藥的化學(xué)成分信息庫。建立"黃連-干姜"液質(zhì)聯(lián)用(UPLC/Q-T0F-MSS)的分析方法,并運用該方法對"黃連-干姜"化學(xué)成分進行分析。根據(jù)色譜保留時間、精確分子量、分子碎片峰、對照品信息和自建的兩味組方藥材的化學(xué)成分信息庫,對主要色譜峰的來源進行了歸屬和鑒定,并且定量測定水提物中 berberine 和 6-gingerol 的含量。2."黃連-干姜"藥對預(yù)防DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎作用及機制研究將45只雄性C57BL/6小鼠隨機分為空白組、模型組、中藥低劑量[1.2g/(kg · d))組、中藥中劑量(2.4g/(kg · d))組、中藥高劑量(4.8g/(kg · d)]組,中藥組預(yù)防性灌胃給藥7d后(空白組和模型組灌胃等量生理鹽水),在繼續(xù)給予相應(yīng)干預(yù)的同時,模型組、中藥組分別給予3%DSS(Dextran Sulfate Dodium)水溶液自由飲用,每2d更換一次,連續(xù)飲用7d,空白組小鼠給予自來水自由飲用。記錄每日疾病活動指數(shù)(Disease Activity Index DAI)評分,取材后測量結(jié)腸長度,HE染色觀察結(jié)腸病理變化并記錄病理組織學(xué)評分,計算臟器指數(shù),ELISA法檢測小鼠血漿中IL-6和TNF-α水平,Western blot法檢測結(jié)腸上皮細胞中NF-κ B、JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平,激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)腸組織中NF-κ B和p-STAT3表達水平。3."黃連-干姜"藥對預(yù)防LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)及其機制研究MTT法檢測0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml "黃連-干姜"水提物對巨噬細胞RAW264.7細胞的殺傷作用。預(yù)防性給予"黃連-干姜"水提物(0、0.5、1、2mg/ml)1h后,給予LPS刺激8h,ELSIA法檢測培養(yǎng)基IL-6和TNF-α的含量,Western blot法檢測RAW264.7細胞中STAT3磷酸化水平,免疫熒光法檢測RAW264.7細胞中p-STAT3和NF-κ B表達水平。4."黃連-干姜"對結(jié)直腸癌細胞系HT29和HCT116的作用及機制研究MTT法檢測0、1、2、4、6、8、15mg/ml "黃連-干姜"水提物對HT-29和HCT116細胞的殺傷作用,給予"黃連-干姜"水提物0、1、1.5mg/ml分別干預(yù)HT-29和HCT116細胞48h后,流式細胞儀PI/Annexin V-FITC雙染色法檢測細胞凋亡率,Western blot法檢測Cleaved Caspase3蛋白表達水平和STAT3蛋白磷酸化水平。結(jié)果:1."黃連-干姜"藥對主要化學(xué)成分的研究建立了 "黃連-干姜"藥對液質(zhì)聯(lián)用的分析方法,并成功運用該方法對"黃連-干姜"藥對化學(xué)成分進行了分析。根據(jù)色譜保留時間、精確分子量、分子碎片峰、對照品信息和自建的兩味組方藥材的化學(xué)成分信息庫,對主要色譜峰的來源進行了歸屬和鑒定,歸屬并鑒定了 28個主要色譜峰,同時定量檢測了 berberine的濃度為54.43 mM,6-gingerol 藥物濃度為 2.2mM。2."黃連-干姜"藥對預(yù)防DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎作用及機制研究模型組動物在飲用3%DSS后從第2天開始,DAI較空白組均升高;與模型組比較,中藥低劑量組在造模后DAI均降低,但僅在飲用3%DSS第2、4、6天差異才有統(tǒng)計學(xué)意義;中藥中劑量組DAI于飲用3%DSS后除了第4天,均低于模型組,并持續(xù)至實驗結(jié)束;中藥高劑量組DAI于飲用3%DSS第2天即低于模型組,并持續(xù)至實驗結(jié)束。模型組小鼠結(jié)腸長度較空白組明顯縮短(P0.01);與模型組相比,中藥低、中劑量組結(jié)腸長度增長(P0.05),中藥高劑量組結(jié)腸長度顯著增長(P0.01)。模型組結(jié)腸組織病理評分較空白組顯著升高(P0.01);與模型組相比,中藥低劑量組結(jié)腸組織病理評分無明顯變化,中藥中劑量組結(jié)腸組織病理評分降低(P0.05),中藥高劑量組結(jié)腸組織病理評分顯著降低(P0.01)。模型組小鼠血漿中IL-6含量較空白組顯著上升(P0.01);與模型組相比,中藥各個劑量組小鼠血漿中IL-6含量較模型組均顯著降低(P0.01)。與空白組相比,模型組血漿中TNF-α含量顯著上升(P0.01),與模型組相比,中藥各個劑量組小鼠血漿中TNF-α含量較模型組均顯著降低(P0.01)。結(jié)腸組織中NF-κ B、JAK2和STAT3蛋白活化水平模型組均顯著高于空白組(P0.01);中藥低、高劑量組小鼠腸上皮細胞中NF-κB蛋白磷酸化水平均比模型組明顯降低(P0.01);和模型組相比,中藥低、高劑量組腸上皮細胞中JAK2蛋白磷酸化水平顯著降低(P0.01),中藥各個劑量組腸上皮細胞中STAT3蛋白磷酸化水平顯著降低(P0.01)。3."黃連-干姜"藥對預(yù)防LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)及其機制研究MTT結(jié)果顯示"黃連-干姜"水提物作用36h對RAW264.7細胞半數(shù)致死濃度為3.79mg/ml,ELSIA結(jié)果發(fā)現(xiàn)"黃連-干姜"水提物可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥因子IL-6和TNF-α分泌水平,Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示"黃連-干姜"可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中NF-κ B和STAT3蛋白的激活。4."黃連-干姜"對結(jié)直腸癌細胞系HT29和HCT116的作用及機制研究MTT結(jié)果顯示"黃連-干姜"水提物可以顯著抑制HT29和HCT116細胞的活力,作用48h的IC50分別為5.648mg/ml和2.43mg/ml。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)"黃連-干姜"水提物可以顯著促進HT29和HCT116的凋亡比率,Western blot結(jié)果顯示"黃連-干姜"可以顯著促進HT29和HCT116細胞中Cleaved Caspase3的表達,抑制STAT3蛋白的磷酸化。結(jié)論:1."黃連-干姜"藥對水提物可以顯著抑制DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型癥狀體征,改善局部病理損傷,抑制DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型血漿炎癥因子的含量,其作用機制可能是通過抑制DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型結(jié)腸局部NF-κ B信號通路及JAK2/STAT 3信號通路的激活而起作用。2."黃連-干姜"可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌,可能是通過抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中NF-κ B和JAK2/STAT3信號通路的激活而起到了作用。3."黃連-干姜"藥對可以顯著抑制結(jié)腸癌細胞系HT29和HCT116的增殖,促進結(jié)腸癌細胞系HT29和HCT116的凋亡,可能是通過抑制結(jié)腸癌細胞系HT29和HCT116細胞中JAK2/STAT3通路關(guān)鍵蛋白STAT3的磷酸化而起到了作用。
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【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2456277