【摘要】：目的:探討涼血通瘀方治療急性腦出血的抗炎機(jī)制以及對(duì)腸道菌群的影響。方法:采用改良自體血注入法建立腦出血大鼠模型,造模成功后,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、涼血通瘀組,于24h、72h、120h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察。從行為學(xué)、腦組織含水量、血腦屏障通透性和腦血腫含量方面觀察涼血通瘀方對(duì)腦出血大鼠腦損害指標(biāo)的影響;從排便作用、腸道平滑肌收縮力方面觀察對(duì)腸道動(dòng)力指標(biāo)的影響;Western blot檢測(cè)腦出血大鼠腦組織NF-κB蛋白表達(dá),ELISA法檢測(cè)腦組織TNF-α、IL-1β表達(dá),研究對(duì)炎性因子的影響;免疫組織化學(xué)、ELISA檢測(cè)大鼠腦、腸組織CCK-8表達(dá),Western blot檢測(cè)腸組織NF-κB蛋白表達(dá),腦組織PKA、P38MAPK、IκκB蛋白表達(dá),闡明本方治療腦出血的抗炎機(jī)制;對(duì)腦出血大鼠糞便樣本進(jìn)行miseq文庫(kù)制備,采用Illumina Miseq 2x300 bp高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析,解析涼血通瘀方對(duì)腦出血大鼠腸道菌群的影響。結(jié)果:1(1)行為學(xué)評(píng)分:涼血通瘀組在腦出血72h、120h神經(jīng)功能明顯改善,缺損評(píng)分低于模型組(P0.05,P0.01),涼血通瘀方可改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損;(2)腦組織血腫含量:涼血通瘀組72h腦血腫含量(21.71±7.31)μl,顯著低于模型組(27.52±6.43)μl;120h 涼血通瘀組(16.53±6.28)μl,顯著低于模型組(24.17±7.21)μ1(P0.01),提示可以明顯促進(jìn)血腫吸收;(3)腦組織含水量:涼血通瘀組在72h、120h腦組織含水量顯著下降(P均0.01),120h含水量接近手術(shù)組,說明可顯著降低腦組織含水量,減輕腦水腫;(4)血腦屏障通透性:涼血通瘀組各時(shí)間點(diǎn)EB含量顯著下降(P均0.01),120hEB含量和假手術(shù)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示可明顯改善腦出血后血腦屏障通透性。2(1)排便作用觀察:模型組糞便多質(zhì)硬或成形,涼血通瘀組糞便多成形或稀軟,涼血通瘀組黑便百分比顯著高于模型組(P0.01),揭示本方可增強(qiáng)胃腸動(dòng)力,促進(jìn)大便排出;(2)腸道平滑肌收縮力:模型組腸道活力值最低,涼血通瘀方治療后腸道收縮頻率、收縮振幅、腸道活力值明顯升高(P0.05,P0.01),揭示腦出血可導(dǎo)致腸蠕動(dòng)減慢,腸道收縮力下降,而經(jīng)涼血通瘀方治療后可加快腸道蠕動(dòng),促進(jìn)腸道平滑肌收縮。3(1)腦組織NF-κB P65蛋白表達(dá):腦出血24h模型組、涼血通瘀組腦組織p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(P0.01,P0.05),72h涼血通瘀組與假手術(shù)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),120h涼血通瘀組顯著低于模型組(P0.01),說明涼血通瘀方可降低p-NF-KB p65蛋白表達(dá),拮抗腦出血后炎性反應(yīng);(2)腦組織TNF-α、IL-1β表達(dá):各時(shí)間點(diǎn)涼血通瘀組TNF-α、IL-1β含量低于模型組(P0.05,P0.01),說明可降低TNF-α、IL-1β表達(dá),發(fā)揮抗炎作用。4(1)血腫周圍腦組織CCK-8表達(dá):各組大鼠24hCCK-8表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,72h、120h涼血通瘀組腦組織CCK-8表達(dá)高于高于模型組(P0.05,P0.01),揭示涼血通瘀方可逐漸增加腦組織CCK-8表達(dá);(2)腸組織CCK-8表達(dá):各組大鼠24h、72h涼血通瘀組腸組織CCK-8表達(dá)高于假手術(shù)組、模型組(P0.01,P0.05),120h各組腸組織CCK-8表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,揭示腦出血后腸組織CCK-8表達(dá)立即升高,72h后逐漸下降,涼血通瘀方可迅速增加腸組織CCK-8表達(dá);(3)腸組織NF-1κBP65蛋白表達(dá):各時(shí)間點(diǎn)涼血通瘀組腸組織p-NF-κB P65蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P均0.01),說明可拮抗腦出血后腸道炎性反應(yīng);(4)腦組織PKA蛋白表達(dá):24h模型組、涼血通瘀組PKA蛋白表達(dá)顯著高于正常組、假手術(shù)組(P均0.01);72h、120h涼血通瘀組PKA蛋白表達(dá)顯著高于模型組(P0.01),揭示涼血通瘀方治療腦出血72h、120h腦組織PKA蛋白表達(dá)明顯升高,與腦組織CCK-8變化趨勢(shì)一致;(5)腦組織P38MAPK蛋白表達(dá):24h模型組P38MAPK蛋白表達(dá)顯著高于正常組、假手術(shù)組(P均0.01),而模型組和涼血通瘀組無明顯差異;72h、120h涼血通瘀組P38MAPK蛋白表達(dá)低于模型組(P均0.05),揭示治療腦出血后腦組織P38MAPK蛋白表達(dá)明顯降低,與腦組織CCK-8變化趨勢(shì)相反;(6)腦組織IκB蛋白表達(dá):24h、72h模型組、涼血通瘀組IκB蛋白表達(dá)均降低,無明顯差異;120h涼血通瘀組IκB蛋白表達(dá)顯著高于模型組(P0.01),與正常組基本一致,揭示本方治療腦出血后IκB蛋表達(dá)逐漸升高,抑制IκB降解,與腦組織NF-κB變化趨勢(shì)基本一致。5(1)Alpha多樣性分析:Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和豐度等級(jí)圖曲線顯示假手術(shù)組5d、涼血通瘀組5d和涼血通瘀組1d大鼠腸道微生物物種豐富度和均勻度最高,模型組3d、假手術(shù)組1d和模型組1d物種豐富度和均勻度最低,說明腦出血可引起腸道微生物豐富度下降、微生物分布紊亂,而經(jīng)涼血通瘀方治療后可恢復(fù)腸道微生物菌群豐富度,促使腸道微生物分布均勻;(2)基于物種信息分析各組樣本的菌落結(jié)構(gòu):以腸道微生物門水平物種結(jié)果為例,假手術(shù)組1d以擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為主,第3d、5d擬桿菌門逐漸減少,厚壁菌門逐漸增多;模型組1d擬桿菌門明顯低于假手術(shù)組,厚壁菌門高于假手術(shù)組,第3d、5d擬桿菌門逐漸增多,厚壁菌門逐漸減少;涼血通瘀組1d擬桿菌門低于假手術(shù)組組,但高于模型組;隨時(shí)間推移第3d、5d擬桿菌門逐漸減少,厚壁菌門逐漸增多,變化趨勢(shì)類似于假手術(shù)組,揭示本方治療腦出血后擬桿菌門逐漸減少,厚壁菌門逐漸增多,類似于假手術(shù)組變化,可恢復(fù)腸道微生物菌群正常構(gòu)成;(3)Beta多樣性分析:門水平樣品聚類樹與柱狀圖組合分析圖結(jié)果顯示涼血通瘀組3d、5d擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門等分布類似;假手術(shù)組3d、5d擬桿菌門、厚壁菌門等分布類似,與涼血通瘀組3d、5d類似;涼血通瘀組3d、5d與假手術(shù)組3d、5d門水平分布類似,與模型組1d、3d、5d、假手術(shù)組1d差異性大,揭示涼血通瘀方治療腦出血大鼠后腸道微生物門水平類似假手術(shù)組分布,可恢復(fù)腸道微生物菌群正常構(gòu)成。結(jié)論:涼血通瘀方可抑制NF-κB、IL-1β、TNF-α等炎性因子水平表達(dá),減輕腦出血炎性反應(yīng),從而促進(jìn)血腫吸收,減輕腦出血大鼠腦水腫,改善血腦屏障通透性,改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能;涼血通瘀方促進(jìn)腸道蠕動(dòng),促進(jìn)腸道平滑肌收縮,依次升高腸組織、腦組織CCK-8含量,腦組織CCK-8通過升高PKA、IκB蛋白表達(dá),降低P38MAPK蛋白表達(dá),抑制腦組織NF-κB p65蛋白表達(dá),調(diào)節(jié)腦腸互動(dòng),發(fā)揮抗炎作用;腦出血后腸道微生物豐富度下降、微生物分布紊亂,涼血通瘀方治療后可恢復(fù)腸道微生物菌群豐富度,促使腸道微生物分布均勻,擬桿菌逐漸減少,厚壁菌逐漸增多,恢復(fù)腸道菌群的正常構(gòu)成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2419239