【摘要】：人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human Epidermal growth factor Receptor 2,HER2,也稱為ErbB2)是受體酪氨酸激酶的ErbB受體家族成員。約20%-30%乳腺癌患者的癌組織中有HER2基因的過度表達(dá),HER2過表達(dá)的乳腺癌浸潤(rùn)性強(qiáng),無病生存期短,預(yù)后差。HER2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白,它沒有天然配體,在單體狀態(tài)下無活性,當(dāng)與ErbB家族其他3個(gè)成員EGFR、HER3、HER4形成異源二聚體時(shí)可使酪氨酸激酶活化,激活MAPK和PI3K/Akt通路,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖。近年來以HER2為靶點(diǎn)的靶向治療已成為乳腺癌治療研究的熱點(diǎn)。Trastuzumab(Herceptin,曲妥珠單抗,赫賽汀)是由美國(guó)Genentech公司開發(fā)的靶向HER2的人源化單克隆抗體,它于1998年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于HER2高表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療。HER2分子的膜外區(qū)包括I、II、III、IV四個(gè)結(jié)構(gòu)域,Trastuzumab與HER2分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域IV結(jié)合,可阻斷配體非依賴的HER2:HER3異源二聚體的形成,但不能阻斷配體依賴的HER2:HER3異源二聚體形成。即使在HER2高表達(dá)乳腺癌,Trastuzumab的有效率也僅為30%。Pertuzumab(Omnitarg,帕妥珠單抗)是美國(guó)Genentech公司研制的另一株的抗HER2人源化抗體。Pertuzumab可通過結(jié)合HER2分子膜外區(qū)的結(jié)構(gòu)域II阻斷配體依賴的HER2:HER3異源二聚體的形成,但不能阻斷配體非依賴的二聚體形成。總的說來,Trastuzumab抑制配體非依賴HER2異源二聚體,而Pertuzumab抑制配體依賴的HER2異源二聚體,它們具有互補(bǔ)的抗腫瘤作用機(jī)理。研究表明Trastuzumab和Pertuzumab的聯(lián)合用藥可以有效抑制體內(nèi)外的腫瘤細(xì)胞增殖。2012年6月美國(guó)FDA已批準(zhǔn)trastuzumab聯(lián)合pertuzumab用于臨床治療HER2過表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌。但雙抗體聯(lián)合治療的療效仍有所不足,其客觀緩解率僅為24%,完全緩解率不足8%。因此,發(fā)展新型HER2靶向治療性抗體或者提供新的抗體組合治療策略顯得迫切重要。本課題首先構(gòu)建了HER2分子胞外段基因的表達(dá)質(zhì)粒,通過真核轉(zhuǎn)染純化制備了HER2分子胞外段蛋白,利用其免疫小鼠使并通過雜交瘤技術(shù)篩選得到一株全新的抗HER2單克隆抗體7C3,競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明Trastuzumab和Pertuzumab均不能與7C3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HER2,提示7C3識(shí)別的抗原表位與Trastuzumab或Pertuzumab識(shí)別的表位均不相同。我們利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)7C3抑制配體依賴的HER2異源二聚化的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在SK-BR-3和BT-474乳腺癌細(xì)胞系中,7C3可以有效抑制EGF刺激的HER2:EGFR異源二聚化。利用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)7C3抑制HER2下游信號(hào)通路的能力進(jìn)行檢測(cè),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示7C3單抗可以顯著降低MAPK磷酸化的水平,但對(duì)Akt磷酸化的影響不明顯。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明7C3抗體能夠有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的體外增殖。為了確定7C3的抗原表位,我們對(duì)7C3和HER2膜外區(qū)蛋白進(jìn)行了共結(jié)晶,在3.1埃分辨率下解析了7C3:HER2復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),結(jié)晶數(shù)據(jù)表明7C3主要與HER2分子的結(jié)構(gòu)域III結(jié)合,部分殘基與結(jié)構(gòu)域II結(jié)合,但遠(yuǎn)離二聚化臂。重要的是,與游離的HER2分子結(jié)構(gòu)相比,當(dāng)7C3結(jié)合HER2時(shí),HER2的二聚化臂發(fā)生了明顯的構(gòu)象改變。我們推測(cè):盡管7C3不直接與HER2分子二聚化臂結(jié)合,但可以通過與HER2結(jié)構(gòu)域III的結(jié)合而使HER2分子發(fā)生構(gòu)象改變,進(jìn)而阻斷HER2異源二聚化的形成及下游信號(hào)通路。綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)了一種新的抗HER2單克隆抗體,與以往所有的HER2抗體不同的是,它能誘導(dǎo)HER2分子發(fā)生構(gòu)象改變。盡管其不直接與HER2分子二聚化臂結(jié)合,仍能有效抑制HER2分子二聚化,繼而阻斷HER2分子下游信號(hào)通路,抑制HER2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。我們的研究結(jié)果還進(jìn)一步闡明了HER2分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系,為乳腺癌的治療提供了新的HER2靶向抗體制劑。這個(gè)新HER2抗體可能與以往的HER2靶向抗體聯(lián)合應(yīng)用提高HER2靶向治療的療效。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2416152