【摘要】：植物凝集素是一類非免疫源的蛋白或糖蛋白,能可逆地、特異地與碳水化合物相互作用。它們廣泛分布于動(dòng)植物中。植物凝集素具有：抗蟲(chóng)、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。利用植物凝集素作為生物機(jī)體中信息媒介這一個(gè)功能,將其應(yīng)用于機(jī)體防御、體外給藥,以及多種疾病的治療具有一定的理論和實(shí)踐意義。本研究通過(guò)ResourceTM Q離子交換柱和SuperdexTM 75 10/300 GL凝膠過(guò)濾柱對(duì)苦蕎凝集素(Tartary buckwheat lectin, TBL)進(jìn)行兩步純化,制備純度較高的TBL,從TBL對(duì)DCs成熟和增殖的影響及其作用機(jī)理,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,防輻射功能及對(duì)實(shí)體瘤小鼠治療四個(gè)方面對(duì)TBL的生物學(xué)活性進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。(1)采用緩沖液抽提、硫酸銨沉淀、透析及ResourceTM Q離子交換柱和Superdex TM 75 10/300 GL凝膠過(guò)濾柱層析等方法從苦蕎麥種子中提取、分離、純化TBL,SDS-PAGE分析其分子量為65 kDa左右。對(duì)其凝血及酶學(xué)活性、酸堿穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性及金屬離子穩(wěn)定性等性質(zhì)進(jìn)行初步研究。結(jié)果顯示TBL對(duì)4種人類血型、小鼠、大鼠及兔的紅血球均有不同效果的凝集作用,并表現(xiàn)出對(duì)O型人血和兔血的偏好性,TBL對(duì)酸堿及3種金屬離子穩(wěn)定,熱變性溫度為64℃。(2)用50μg/mL的TBL聯(lián)合5×10-5 mol/L重組人白介素4 (rhIL-4)刺激未成熟DCs可促進(jìn)外周血中樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和增殖,作用強(qiáng)于20 ng/mL的重組人腫瘤壞死因子α (rhTNF-α)。樹(shù)突狀細(xì)胞在含50μg/mL TBL的培養(yǎng)基中孵育48 h后,CD83和CD40表達(dá)上調(diào),并且能釋放促炎因子白介素10(IL-10)和白介素12(IL-12)。(3)采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),以人淋巴瘤細(xì)胞株U937及小鼠肝癌細(xì)胞株H22為靶細(xì)胞,用不同濃度TBL體外處理,采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖、caspase試劑盒活性檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡等方法研究TBL在體外對(duì)兩種不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示TBL在體外對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞株U937和小鼠肝癌細(xì)胞株H22有較強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)作用,呈劑量依賴性關(guān)系。TBL還可以誘導(dǎo)人淋巴瘤U937細(xì)胞凋亡,當(dāng)用TBL作用于腫瘤細(xì)胞后,caspase-8和caspase-9同時(shí)被激活,表明TBL可能通過(guò)誘導(dǎo)caspase-9直接激活caspase-8進(jìn)而激活caspase-3來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。(4)采用黃芪、DCs移植及TBL-DCs聯(lián)合移植方法對(duì)醫(yī)用劑量為4 Gy的X射線直線加速器照射小鼠進(jìn)行治療,通過(guò)觀察輻射損傷小鼠WBC和PLT、胸腺和脾指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖、外周血淋巴細(xì)胞亞群、骨髓細(xì)胞DNA含量和凋亡的影響來(lái)考查三種治療方案對(duì)輻射損傷造成的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果顯示,黃芪、DCs移植及TBL-DCs聯(lián)合移植都能夠增加受照小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù),提升受輻照小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及脾淋巴細(xì)胞增殖率,其中TBL-DCs移植組效果最好；TBL-DCs聯(lián)合移植對(duì)治療小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+25、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞CD16+損傷效果最佳,說(shuō)明TBL-DCs聯(lián)合移植對(duì)受輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有很好的保護(hù)作用。黃芪、DCs移植及TBL-DCs聯(lián)合移植都能夠增加受輻射小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量,而DCs移植及TBL-DCs聯(lián)合移植能降低骨髓細(xì)胞凋亡率,同時(shí)還有降低骨髓細(xì)胞微核率發(fā)生的作用,以TBL-DCs聯(lián)合移植效果最佳；說(shuō)明TBL-DCs聯(lián)合移植能顯著降低輻射導(dǎo)致的DNA損傷。以上表明,TBL-DCs聯(lián)合移植不但對(duì)機(jī)體的造血系統(tǒng)有顯著的保護(hù)作用,而且能夠促進(jìn)受輻射損傷機(jī)體造血功能的恢復(fù),調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),維持DNA微核等遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定,能顯著保護(hù)機(jī)體免受電離輻射損傷。(5)用TBL刺激小鼠DCs,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表面抗原Dectin-1、CD40、CD80、CD86和MHCII的表達(dá),ELISA檢測(cè)Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-6和IL-23,Thl相關(guān)細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平。實(shí)體瘤小鼠靜脈注射TBL-DCs結(jié)果顯示TBL刺激DCs Dectin-1信號(hào)途徑,上調(diào)CD40、CD80、CD86和MHCII的表達(dá)刺激外周血單核細(xì)胞,增加各種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,活化效應(yīng)性T淋巴來(lái)提高機(jī)體免疫力。通過(guò)對(duì)實(shí)體瘤小鼠靜脈注射TBL-DCs研究發(fā)現(xiàn),TBL-DCs不僅可以引起機(jī)體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)而且可以同時(shí)引發(fā)全身性的抗腫瘤效應(yīng)。TBL可能作為一種免疫增強(qiáng)劑在增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)、抑制腫瘤生長(zhǎng)等方面具有顯著的作用和發(fā)展的潛力。
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【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392;Q946
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本文編號(hào)：2415368