【摘要】：疼痛的預(yù)防和治療一直以來是國際醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。對于創(chuàng)傷、手術(shù)、燒傷等引發(fā)的陣痛或腫瘤放療、化療引發(fā)的強烈疼痛,阿片類藥物嗎啡具有很好的鎮(zhèn)痛效果。然而,嗎啡用藥后產(chǎn)生的耐受性等卻嚴(yán)重阻礙了其藥效的發(fā)揮。嗎啡主要由尿苷葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate-glucuronosyltransferase 2B7,UGT2B7)介導(dǎo),通過與葡萄糖醛酸分子發(fā)生結(jié)合反應(yīng)形成嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷(morphine-3-glucuronide,M3G)和嗎啡-6-葡萄糖醛酸苷(morphine-6-glucuronide,M6G)兩種主要代謝產(chǎn)物,其中M6G的鎮(zhèn)痛能力遠(yuǎn)強于嗎啡原型,M3G則沒有明顯的鎮(zhèn)痛活性,但是卻能拮抗M6G產(chǎn)生的耐受作用。因此,使用嗎啡鎮(zhèn)痛時,若在耐受發(fā)生后M6G的生成適當(dāng)減少將有助于鎮(zhèn)痛效果的發(fā)揮。嗎啡代謝產(chǎn)物生成后需要通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,但是目前對于嗎啡及其葡萄糖醛酸代謝物如何進(jìn)入腦內(nèi)的機(jī)制尚未明確。本文從嗎啡的代謝和轉(zhuǎn)運角度,重點研究主要藥物代謝酶和血腦屏障攝取轉(zhuǎn)運體對嗎啡代謝產(chǎn)物生成和轉(zhuǎn)運的選擇性機(jī)制,分析基因多態(tài)性、蛋白二聚化、表觀遺傳因素、內(nèi)源性代謝物等對嗎啡鎮(zhèn)痛效果及耐受性逆轉(zhuǎn)作用的影響。1.嗎啡及其兩種葡萄糖醛酸代謝物的HPLC-MS/MS分析方法的建立為了對嗎啡的兩種代謝物濃度進(jìn)行分析,我們建立了用于在不同生物基質(zhì)中快速檢測嗎啡及其葡萄糖代謝產(chǎn)物M3G和M6G的濃度的HPLC-MS/MS方法。以lOng/mL 同位素標(biāo)記的 M6G-d3 為內(nèi)標(biāo),采用 AglientHILICPLUSSB-C18(2.1_mm×50mm,3.5μm)色譜柱和含有0.5‰甲酸的純水溶液和純甲醇溶液(pH3.2)作為流動相,梯度洗脫對樣品進(jìn)行分離。質(zhì)譜儀在正離子模式下采用多離子反應(yīng)檢測模式(mltiplereaction monitoring,MRM),三種特征離子碎片分別為嗎啡m/z286.0-200.9,M3G 和 M6G 均為 m/z462.1-286.1,M6G-d3 為 m/z465.1-289.1。驗證結(jié)果顯示,該方法的專屬性良好,在各基質(zhì)中三種化合物的線性范圍為0.05ng到10ng,范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)r2值均在0.9930以上,定量下限(LLOQ)均為0.05ng/mL,低中高濃度待測物精密度和準(zhǔn)確度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和偏差范圍均符合相關(guān)要求,同時在不同基質(zhì)中無明顯的基質(zhì)效應(yīng)存在,樣品穩(wěn)定性良好。因此,該方法可用于嗎啡及兩種葡萄糖醛酸代謝物在不同生物基質(zhì)中濃度測定。2.UGTs及其突變體之間的二聚化作用對嗎啡葡萄糖醛酸化代謝的影響研究UGT2B7、UGT1A1和UGT1A9及其它們的突變體蛋白之間能發(fā)生二聚化,并影響催化嗎啡代謝的選擇性。我們應(yīng)用UGTs重組蛋白包括野生型UGT2B7*1及三個突變體*71S(A71S,211GT)、*2(H268Y,802CT)、*5(D398N,1192GA)重組蛋白及其與 UGT1A9*1、UGT1A9*2(C3Y,8GA)、UGT1A9*3(M33T,98TC)、UGT1A9*5(D256N,766GA)、UGT1A1 及剪切突變體 UGT1A1b 分別形成的二聚體,采用HPLC-MS/MS方法測定孵育液中嗎啡代謝物M3G和M6G濃度,并進(jìn)行酶動力學(xué)參數(shù)分析。研究表明:相比于UGT2B7野生型和突變體,它們與UGT1A1和UGT1A9形成的蛋白二聚化重組酶能夠顯著提升催化嗎啡代謝的能力。相比于UGT2B7*1、UGT2B7*2突變體、二聚化重組酶催化嗎啡生成M3G和M6G時具有更低的Km值;而UGT2B7*5卻與之相反。研究還顯示,UGT1A9*2或UGT1A9*5與UGT2B7形成的二聚化重組酶有利于M6G的生成;絕大多數(shù)UGT2B7的突變體或二聚化重組酶能夠顯著降低M3G與M6G的生成量比值,即生成較多的M6G。綜上,UGT2B7野生型或突變體與UGT1A1、UGT1A9野生型或突變體之間形成的二聚化作用在改變酶的活性同時影響嗎啡代謝產(chǎn)物生成的選擇性。3.結(jié)直腸癌中UGT2B7表達(dá)降低對嗎啡葡萄糖醛酸化代謝的影響和機(jī)制研究臨床樣品的分析結(jié)果顯示UGT2B7在結(jié)直腸癌組織中顯著性降低,提示表觀遺傳因素也可能影響UGT2B7催化嗎啡的代謝。同時,UGT2B7底物嗎啡能夠在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中通過上調(diào)組蛋白3位的正調(diào)節(jié)信號如H3K4Me3或H3K27Ac等來激活UGT2B7表達(dá)。深入研究發(fā)現(xiàn)腦源性分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF在結(jié)直腸腫瘤中能夠與UGT2B7發(fā)生蛋白-蛋白相互作用并顯著抑制后者的表達(dá),其機(jī)制是激活其啟動子上H3K27Ac的同時下調(diào)H3K4Me3信號。BDNF的下調(diào)導(dǎo)致多梳蛋白復(fù)合物PRC1激活,而由于核心元件SUZ12受到抑制,PRC2呈現(xiàn)相反的狀態(tài)。嗎啡的兩種葡萄糖醛酸代謝物在BDNF被抑制、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑BIX-01294、去乙酰化酶抑制劑TSA處理的耐受樣HCT-116細(xì)胞中均明顯增加,其中M6G的量增加更多。因此,嗎啡用于腫瘤鎮(zhèn)痛過程中,UGT2B7酶活性的降低和M3G/M6G增加可導(dǎo)致嗎啡耐受性減弱。4.石膽酸介導(dǎo)的UGT2B7下調(diào)對于逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受性作用的研究一些內(nèi)源性化合物也會干預(yù)UGT2B7的活性作用發(fā)揮。如原發(fā)性膽汁性肝硬化病人往往伴隨肝內(nèi)的膽酸淤積,并誘發(fā)肝損傷,并通常會伴隨著強烈疼痛的發(fā)生,需要強效鎮(zhèn)痛藥如嗎啡進(jìn)行止痛。我們發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受樣細(xì)胞HL-7702給予次級膽酸石膽酸(LCA)后UGT2B7的表達(dá)水平明顯下降。而嗎啡耐受后原本表達(dá)下調(diào)的MOR受體和鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα),呈現(xiàn)出明顯的逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。小鼠給予LCA(10,50,100mg/kg)7天后能顯著降低相同劑量嗎啡給藥引發(fā)的急性和慢性嗎啡耐受性。鑒于小鼠肝臟內(nèi)的UGT2B7有顯著的下調(diào),我們采用固相萃取(SPE)結(jié)合HPLC-MS/MS方法對急慢性嗎啡耐受小鼠中代謝物M3G和M6G的濃度進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)嗎啡和M6G及M3G和M6G的比值均顯著下調(diào)。在給予50mg/kg LCA后,急慢性嗎啡耐受小鼠前額皮層中環(huán)磷酸腺苷cAMP濃度顯著下降,T286位CaMKⅡα磷酸化水平顯著上調(diào),提示LCA能夠影響耐受小鼠腦內(nèi)信號的磷酸化水平。以上研究表明,LCA淤積能夠?qū)е滦∈蟾闻K內(nèi)UGT2B7的表達(dá)下調(diào),使得嗎啡代謝的選擇性改變,嗎啡和M6G及M3G和M6G的比值均顯著下降,進(jìn)而減輕急慢性嗎啡的耐受效應(yīng)。因此,嗎啡用于LCA淤積產(chǎn)生的疼痛治療可能不易產(chǎn)生耐受,預(yù)期可增強其鎮(zhèn)痛效果。5.OATP2B1介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)嗎啡急性耐受性的機(jī)制研究調(diào)控嗎啡的腦轉(zhuǎn)運過程能顯著影響嗎啡鎮(zhèn)痛能力的發(fā)揮并改善其耐受狀態(tài)。因此,我們開展了嗎啡及代謝產(chǎn)物腦內(nèi)攝取的新途徑研究,結(jié)果顯示有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽(OATP2B1)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中嗎啡和M6G的轉(zhuǎn)運量明顯高于MOCK細(xì)胞,該轉(zhuǎn)運體與嗎啡的親和力是M6G的1.4倍(Km分別為嗎啡57.58±8.9μM,M6G 80.31±21.75μM),同時環(huán)孢菌素A(CsA)作為OATP2B1的抑制劑能抑制嗎啡和M6G的細(xì)胞攝取量(嗎啡 IC50=3.90±0.50μM;M6G IC50=6.04±0.86μM)。為 了探究OATP2B1對于嗎啡的轉(zhuǎn)運和耐受的影響,我們采用DGL-PEG/demorphin腦靶向復(fù)合體納米粒攜載siRNA(OATP2B1)在小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3細(xì)胞中驗證功能后給予小鼠尾靜脈注射,發(fā)現(xiàn)小鼠大腦和小腦中OATP2B1的表達(dá)顯著下調(diào),而嗎啡和M6G的濃度顯著下降。同時我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)OATP2B1同時給予產(chǎn)生達(dá)到耐受劑量的嗎啡后,MOR受體和CaMKIIα均上調(diào),而T286位磷酸化CaMKⅡα呈現(xiàn)下調(diào),提示下調(diào)OATP2B1會阻斷嗎啡和M6G的腦轉(zhuǎn)運,并逆轉(zhuǎn)急性嗎啡耐受。這一發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步研究嗎啡腦轉(zhuǎn)運和鎮(zhèn)痛活性之間的聯(lián)系。上述研究對嗎啡臨床鎮(zhèn)痛效果的改善具有參考意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285

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本文編號：2411553