【摘要】：目的線(xiàn)粒體是阿霉素(Doxorubicin,DOX)心臟毒性作用的關(guān)鍵靶標(biāo),DOX誘導(dǎo)的心肌損傷的發(fā)生與發(fā)展與線(xiàn)粒體功能障礙密切相關(guān)。氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α(PGC-1α)是維持線(xiàn)粒體功能的重要分子,其介導(dǎo)的線(xiàn)粒體新生是維持線(xiàn)粒體數(shù)量平衡、保證線(xiàn)粒體正常功能的重要活動(dòng)。DOX引發(fā)心臟毒性時(shí)會(huì)出現(xiàn)PGC-1α下調(diào)、線(xiàn)粒體新生障礙和線(xiàn)粒體功能紊亂,提示PGC-1α及其介導(dǎo)的線(xiàn)粒體新生障礙和線(xiàn)功能紊亂與DOX心肌毒性密切相關(guān),但其具體調(diào)控方式和作用機(jī)制均不清楚。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulation 2 homolog 1,SIRT1)是一種組蛋白去乙�；�,是PGC-1α去乙�；せ蠲�。有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1缺失會(huì)導(dǎo)致PGC-1α乙�；缴吆突钚越档�,加劇心肌線(xiàn)粒體損傷,提示SIRT1去乙酰化修飾是PGC-1α及與其相關(guān)的線(xiàn)粒體功能的重要調(diào)控機(jī)制。本研究假設(shè)SIRT1通過(guò)PGC-1α去乙�；揎椇途�(xiàn)粒體功能調(diào)節(jié)發(fā)揮其抗DOX心肌毒性作用。希望闡明DOX心臟毒性中SIRT1/PGC-1α在線(xiàn)粒體功能調(diào)節(jié)中的相互關(guān)系和作用特點(diǎn),為深入探索DOX心臟毒性新機(jī)制、臨床毒副作用防治提供新思路。方法1.本研究首先對(duì)考察了SIRT1激活(激活劑RSV)或抑制(siRNA基因敲降)條件下,DOX所致細(xì)胞毒性、線(xiàn)粒體新生障礙和線(xiàn)粒體功能的變化,論證SIRT1在DOX所致心肌線(xiàn)粒體毒性作用機(jī)制中的重要靶標(biāo)作用。SIRT1激活研究選擇了表征線(xiàn)粒體功能的指標(biāo),如采用流式細(xì)胞檢測(cè)法檢查細(xì)胞ROS和超氧化物含量、熒光顯微成像技術(shù)檢查線(xiàn)粒膜電位、試劑盒檢查ATP含量、CS活性等指標(biāo)。同時(shí)還考察了反映線(xiàn)粒體新生的一系列指標(biāo),如Real-Time PCR檢查mtDNA拷貝數(shù)變化、熒光顯微成像技術(shù)檢查線(xiàn)粒含量、Western blot檢查PGC-1α介導(dǎo)的新生通路蛋白表達(dá);并利用試劑盒檢測(cè)了SIRT1酶活性、IP和Western Blot方法檢查了SIRT1蛋白表達(dá)及PGC-1α的乙�；阶兓�,以考察SIRT激活對(duì)整個(gè)細(xì)胞和線(xiàn)粒體新生和功能的有益作用。隨后利用siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染構(gòu)建SIRT1敲降細(xì)胞模型。利用該SIRT1敲降細(xì)胞考察DOX對(duì)細(xì)胞毒性、線(xiàn)粒體功能和新生的影響,分別考察了線(xiàn)粒體功能指標(biāo)如細(xì)胞ROS、MMP、ATP含量,線(xiàn)粒體新生指標(biāo)如mtDNA拷貝數(shù)、線(xiàn)粒體含量等,以論證SIRT1在維持正常細(xì)胞和線(xiàn)粒體功能、線(xiàn)粒體新生中的關(guān)鍵作用。2.本研究隨后考察了SIRT1在EPO發(fā)揮心臟保護(hù)中的關(guān)鍵作用。通過(guò)Western blot初步確定EPO對(duì)SIRT1有激活作用后,對(duì)EPO的保護(hù)效果與SIRT1是否有關(guān)進(jìn)行考察。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線(xiàn)粒體內(nèi)超氧化物含量、JC-1染色熒光酶標(biāo)法測(cè)定MMP以觀察EPO抗DOX線(xiàn)粒體功能損傷作用;通過(guò)Western blot考察線(xiàn)粒體新生通路PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白表達(dá)、線(xiàn)粒體內(nèi)參蛋白VDAC、COXIV蛋白表達(dá)、PCR檢測(cè)mt DNA拷貝數(shù)變化以觀察EPO抗DOX線(xiàn)粒體新生障礙的作用。還著重檢測(cè)了EPO抗DOX引起的SIRT1酶活性和蛋白表達(dá)降低以及PGC-1α乙�；缴�。為進(jìn)一步確定EPO的抗DOX毒性作用依賴(lài)于SIRT1存在,再次利用SIRT1敲降細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),選擇線(xiàn)粒體功能指標(biāo)如線(xiàn)粒體超氧化物含量、ATP含量和MMP;線(xiàn)粒體新生指標(biāo)如新生通路相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行考察。3.最后本研究比較了單次給藥和重復(fù)給藥對(duì)細(xì)胞存活率和SIRT1/PGC-1α通路的影響。首先根據(jù)BMD(基準(zhǔn)劑量法)利用BMDS2.5.0軟件擬合細(xì)胞生存率曲線(xiàn),比較低劑量重復(fù)給藥后的細(xì)胞與單次給藥細(xì)胞的IC50和存活率BMDL值的變化;接著用Western blot檢測(cè)相同累積劑量不同給藥頻率單次給藥和重復(fù)給藥細(xì)胞SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達(dá)的不同。結(jié)果1.SIRT1在RSV抗DOX毒性中的關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DOX對(duì)AC16細(xì)胞生存率、線(xiàn)粒體新生和功能、SIRT1去乙酰化酶活性都有明顯抑制作用。而RSV能夠顯著提高同等DOX劑量下心肌細(xì)胞的存活率,改善線(xiàn)粒體功能,如降低ROS生成、改善MMP降低、CS活性抑制。RSV還能改善DOX對(duì)線(xiàn)粒體新生通路的抑制,逆轉(zhuǎn)阿霉素引起的線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)降低,增強(qiáng)線(xiàn)粒體新生,增加線(xiàn)粒體數(shù)量。同時(shí)Western Blothe和IP結(jié)果也顯示,DOX引起的SIRT1活性降低和PGC-1α乙�；降纳呔躌SV的保護(hù)而發(fā)生明顯改善。同時(shí),SIRT1敲降則加劇DOX對(duì)線(xiàn)粒體新生、線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響。SIRT1敲降細(xì)胞在相同DOX給藥下存活率更低、線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)和線(xiàn)粒體含量也降低更多,提示SIRT1表達(dá)降低會(huì)引起線(xiàn)粒體新生障礙。熒光顯微成像結(jié)果也顯示SIRT1敲降加劇了DOX導(dǎo)致的線(xiàn)粒體MMP的降低、ATP合成降低和ROS堆積,線(xiàn)粒體功能受到更加嚴(yán)重的破壞。RSV的保護(hù)作用也因?yàn)镾IRT1敲降而顯著削弱。2.EPO抗DOX心臟毒性新機(jī)制與SIRT1的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)首先確認(rèn)AC16細(xì)胞中EPOR的存在及EPO對(duì)SIRT1的確具有激活作用。接著實(shí)驗(yàn)考察了給藥24 h的DOX引起AC16細(xì)胞毒性和線(xiàn)粒體功能障礙,以及EPO的保護(hù)作用。EPO能夠顯著改善DOX引起的AC16細(xì)胞生存率降低、線(xiàn)粒體功能障礙和線(xiàn)粒體新生障礙,如緩解DOX線(xiàn)粒體內(nèi)超氧化物堆積、SOD和CS表達(dá)降低以及MMP降低。同時(shí),Western Blot和Real-time PCR結(jié)果顯示EPO還能夠顯著改善DOX引起的線(xiàn)粒體新生抑制,表現(xiàn)為緩解DOX造成的PGC-1α通路相關(guān)蛋白表達(dá)下降、mtDNA拷貝數(shù)降低、SIRT1和PGC-1α的mRNA表達(dá)降低。DOX造成的SIRT1蛋白表達(dá)和活性抑制、PGC-1α乙�；降纳�,均由于EPO的保護(hù)作用發(fā)生顯著改善。同時(shí),SIRT1敲降細(xì)胞在相同DOX給藥劑量下也表現(xiàn)出更大的細(xì)胞毒性、更嚴(yán)重的線(xiàn)粒體新生和功能障礙,具體表現(xiàn)為mtDNA拷貝數(shù)降低更多,超氧化物生成量增加、ATP含量、MMP等指標(biāo)均較未敲降細(xì)胞降低更多,且EPO的保護(hù)作用也因?yàn)镾IRT1的敲降而遭到明顯削弱。提示EPO的保護(hù)作用依賴(lài)SIRT1存在。3.單次給藥與重復(fù)給藥對(duì)細(xì)胞重要指標(biāo)的影響。方案A低劑量重復(fù)給藥后的細(xì)胞與單次給藥細(xì)胞的IC50和存活率BMDL值進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)低劑量重復(fù)給藥3天的細(xì)胞較單次給藥細(xì)胞對(duì)DOX毒性的耐受力顯著提高,表現(xiàn)為IC50值和BMDL增大;而相同低劑量重復(fù)給藥6天的細(xì)胞則較單次給藥細(xì)胞對(duì)DOX毒性作用的耐受力顯著降低,表現(xiàn)為IC50和BMDL降低。方案B相同累積劑量不同給藥頻率單次給藥和重復(fù)給藥細(xì)胞SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)相同累積給藥劑量下,重復(fù)給藥導(dǎo)致SIRT1、PGC-1α及線(xiàn)粒體新生通路蛋白表達(dá)與單次給藥相比呈現(xiàn)顯著差異,重復(fù)給藥較單次給藥所造成的蛋白表達(dá)抑制更加嚴(yán)重。結(jié)論1.SIRT1是DOX毒性作用關(guān)鍵靶標(biāo),也是保護(hù)藥物抗DOX毒性作用的潛在活性靶點(diǎn)。本研究展示了已知的SIRT1激動(dòng)劑RSV和保護(hù)機(jī)制未知的EPO在抗DOX心肌毒性中所表現(xiàn)出相似的對(duì)SIRT1激活、對(duì)線(xiàn)粒體功能和線(xiàn)粒體新生的促進(jìn)作用,發(fā)現(xiàn)該保護(hù)作用均表現(xiàn)為對(duì)SIRT1的依賴(lài)性。在DOX引起的心肌毒性中,SIRT1由于其脫乙酰酶活性受到抑制而對(duì)線(xiàn)粒體新生通路產(chǎn)生擾動(dòng),造成線(xiàn)粒體新生及線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)、功能障礙;而SIRT1激活劑則能夠明顯對(duì)抗DOX引起的線(xiàn)粒體毒性,維持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的相對(duì)穩(wěn)定。因此SIRT1有可能成為防治DOX心肌毒性的重要靶點(diǎn),具有SIRT1激活作用的藥物有希望作為DOX聯(lián)合用藥的保護(hù)藥,減輕DOX臨床毒副作用,具有臨床現(xiàn)實(shí)意義。此外,SIRT1作為一種線(xiàn)粒體毒性通路關(guān)鍵分子,通過(guò)其自身活性變化和對(duì)目標(biāo)分子的翻譯后修飾調(diào)節(jié),在維持心肌細(xì)胞正常生理功能中發(fā)揮重要作用;以此引申到其他翻譯后修飾作用,也具有成為新的毒性作用靶標(biāo)和治療靶標(biāo)的潛力和前景,這對(duì)于探索藥物毒性作用新機(jī)制、尋找有效保護(hù)藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。2.體外實(shí)驗(yàn)DOX單次給藥和重復(fù)給藥對(duì)生存率和蛋白表達(dá)產(chǎn)生不同影響。重復(fù)給藥較單次給藥引起細(xì)胞對(duì)DOX的IC50、生存率BMDL發(fā)生顯著偏移;SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達(dá)發(fā)生顯著差異。提示單次給藥和重復(fù)給藥有可能涉及不同分子機(jī)制,需要進(jìn)一步的詳細(xì)全面的論證和更為深入的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R965

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本文編號(hào)：2411430