【摘要】：目的研究附子的主要有效成分次烏頭堿(Hypaconitine,HA)及甘草的主要有效成分甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)不同配伍比例在缺氧缺糖(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)模型H9c2心肌細胞的作用及相關(guān)機制;并建立大鼠慢性心衰模型,觀察HA配伍GA對慢性心衰大鼠的抗心衰的相關(guān)作用及機制研究。為探討附子甘草配伍的基礎理論提供依據(jù),并為臨床應用附子甘草配伍治療心肌缺血及慢性心衰等心臟病提供實驗依據(jù)。方法(1)HA、GA及陽性對照藥地高辛對H9c2心肌細胞的最適作用濃度范圍的研究:使用MTT法測OD值,根據(jù)細胞存活率公式測得各藥物的非細胞毒性濃度范圍。(2)HA配伍GA對OGD模型下心肌細胞的抗炎及抗細胞凋亡作用的最佳配伍比例的研究:建立H9c2心肌細胞的OGD模型,分為正常組、模型組、地高辛組(80μmol·L-1)、HA 組及 HA+GA 組:1:0.5 組、1:1 組、1:2 組(HA 為 120μmol·L-1,GA 分別為 60、120、240μmol·L-1),作用4h;觀察各組H9c2心肌細胞形態(tài)學的變化情況,并應用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β及CK的含量并應用Western Blot法測定心肌細胞caspase-3、Fas及Fas-L蛋白的表達情況。(3)HA與GA的最佳配伍比例對OGD模型下H9c2心肌細胞的抗心肌細胞凋亡的作用及機制研究:實驗分為模型組,HA組、GA組、HA+GA組、LY294002(LY)組,HA+GA+LY 組(HA 為 120μmol·L-1,GA 為120μmol·L-1,LY 為10μmol·L-1),作用 4h;再應用Hoechst33342染色于熒光顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)變化,應用透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)變化情況,應用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中的LDH、CK-MB及AST的含量變化,應用流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率,并應用WestemBlot法檢測Akt、p-Akt、caspase-9、Bax及Bcl-2蛋白水平的含量變化。(4)HA配伍GA對慢性心衰大鼠的心肌細胞凋亡信號通路的影響的研究:建立大鼠慢性心衰模型,隨機分為假手術(shù)(Sham)組、模型(Model)組、地高辛(Digoxin)組、HA組、GA 組、HA+GA 組(HA 為 2.07mg/kg,GA 為 25mg/kg,地高辛為 lmg/kg);每日灌胃給藥1次,一周后,觀察大鼠一般情況改變,計算死亡率,應用心臟超聲檢測EF、FS等參數(shù);應用電子秤測大鼠體重及心臟重量;應用ELISA法檢測血清BNP及cTnI的含量變化;應用免疫組織化學法檢測心肌組織的Bax、Bcl-2及caspase-3表達的變化情況;并應用Western Blot法測定大鼠心肌組織的Bax、Bcl-2及caspase-3蛋白表達的情況。結(jié)果(1)MTT實驗結(jié)果顯示:HA、GA及地高辛的非細胞毒性濃度范圍分別為0-120μmol·L-1、0-240μmol·L-1 及 0-80μmol·L-1。(2)HA配伍GA不同比例對H9c2心肌細胞的作用結(jié)果:細胞形態(tài)學以配伍組(1:1)改善最明顯;同時配伍組(1:1)明顯減少TNF-α、IL-1β及CK的含量;并且配伍組(1:1)極顯著性地減少caspase-3、Fas及Fas-L蛋白表達。(3)HA配伍GA(1:1)對OGD心肌細胞的作用結(jié)果:Hoechst33342染色顯示配伍組較其它各組更明顯地改善細胞核及染色質(zhì)形態(tài);透射電鏡顯示配伍組顯著改善細胞膜,線粒體腫脹及細胞核、染色質(zhì)濃縮等現(xiàn)象;上清液的LDH、CK-MB及AST含量變化,顯示HA+GA配伍組明顯減少其釋放量;流式細胞儀檢測結(jié)果顯示HA+GA配伍組能顯著降低細胞早期凋亡率;Western Blot法檢測結(jié)果顯示,p-Akt/Akt比值在HA+GA+LY組較HA+GA組顯著下降;caspase-9及Bax含量在HA+GA+LY組較HA+GA組明顯升高;Bcl-2蛋白含量在HA+GA+LY組較HA+GA組顯著下降。(4)HA+GA組大鼠的一般情況改善最多,大鼠死亡率為15.56%;HA+GA組顯著性降低H/B比值;心臟超聲結(jié)果顯示HA+GA組可顯著改善大鼠的心臟左心室重構(gòu)的現(xiàn)象;配伍組顯著降低血清BNP及cTnI的水平;免疫組織化學染色法及Western Blot法檢查結(jié)果均顯示HA+GA組明顯降低Bax及caspase-3蛋白的表達情況,同時顯著升高Bcl-2蛋白的表達及Bcl-2/Bax比值。結(jié)論(1)附子與甘草的主要有效成分HA配伍GA作用于H9c2心肌細胞的最佳比例為(1:1)。(2)附子甘草的主要有效成分HA及GA配伍對H9c2心肌細胞的OGD損傷有保護作用,其作用機制可能與抗炎和抗凋亡途徑有關(guān)。(3)附子與甘草的主要有效成分HA及GA配伍對OGD模型下的H9c2心肌細胞可產(chǎn)生保護作用;其保護作用機制與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。(4)附子與甘草的主要有效成分HA及GA配伍可有效地改善慢性心衰過程中的心肌肥厚、心肌重構(gòu)及心功能減弱等狀態(tài),其作用機制可能與抑制心肌細胞的凋亡有關(guān)。
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【學位授予單位】：浙江中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2401908