【摘要】：表觀遺傳學是涉及基因表達可遺傳的變化但DNA序列未改變的研究。表觀遺傳調(diào)控的機制包括DNA和組蛋白修飾,染色體重組及無編碼RNA等�，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)顯示表觀遺傳的異常調(diào)控是促進腫瘤發(fā)生的原動力之一。眾所周知,腫瘤細胞通過重編程細胞內(nèi)代謝來滿足其生長和增殖所需要的大量的營養(yǎng)物質(zhì)。細胞代謝重編程不僅改變了細胞命運,還改變了普通細胞的代謝途徑:有氧糖酵取代了正常的有氧呼吸和糖酵解途徑,將其從產(chǎn)生能量的分解代謝通路轉(zhuǎn)變?yōu)樯锖铣赏?進而為氨基酸,核酸和脂類等的生物合成提供了原料,進一步滿足了細胞生長和增殖的合成代謝需要。而我們的前期研究顯示KDM4C在腫瘤細胞命運和細胞代謝重編程中起著重要作用,且其在多種腫瘤細胞中都是基因擴增和高表達的,包括淋巴瘤(lymphoma),乳腺癌(breast cancer),食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma),肺肉瘤樣癌(lung sarcomatoid carcinoma)和人髓母細胞瘤(medulloblastoma)。因此針對KDM4C的研究,有利于我們認清組蛋白甲基化修飾表觀調(diào)控細胞命運和代謝重編程的分子機制,為治療腫瘤相關(guān)疾病提供一些藥物靶標的參考。本論文對組蛋白去甲基化酶KDM4C主導(dǎo)的協(xié)調(diào)氨基酸代謝和細胞周期進程之間聯(lián)系的表觀遺傳學機制進行了探究;同時發(fā)現(xiàn)了KDM4C與轉(zhuǎn)錄激活因子ATF4之間的關(guān)系。這些結(jié)果都揭示了KDM4C在腫瘤形成及擴張中具有一些新的生物學功能,其結(jié)論如下所示:1.KDM4C基因?qū)τ诮z氨酸生物合成信號通路基因的表達和腫瘤細胞的增殖是必須的在細胞水平將KDM4C基因沉默后,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞內(nèi)H3K9me3的整體水平明顯上調(diào);而同為KDM4家族的具有相似功能的其他基因的m RNA表達水平無明顯的增加,這說明KDM4C對H3K9me3的去甲基化是一個相對獨立的過程,且沉默KDM4C對其他KDM4家族基因無明顯的影響。此外,沉默KDM4C明顯地抑制了腫瘤細胞生長增殖和形成細胞克隆的能力,這和Cloos et al.,Kim et al.等人的結(jié)果一致。另外,我們對BE(2)-C細胞進行了染色質(zhì)免疫共沉淀實驗,,并做了Ch IP-q PCR;結(jié)果顯示,KDM4C可結(jié)合在絲氨酸生物合成通路中的某些基因的啟動子區(qū)域。我們將Pedersen et al.等人在人類食管鱗狀細胞癌細胞(human esophageal squamous cell carcinoma)KYSE150中沉默KDM4C的Ch IP-seq數(shù)據(jù)結(jié)果與人類基因組進行了比對分析,發(fā)現(xiàn)絲氨酸生物合成信號通路基因位點下均有較大峰值(peak)出現(xiàn),這與我們Ch IP-q PCR數(shù)據(jù)結(jié)果一致。由此可說明KDM4C對這些基因都有激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。換而言之,KDM4C對絲氨酸合成信號通路的激活起著重要的作用。總之,我們的數(shù)據(jù)證實至少在表觀遺傳調(diào)控被激活時期,KDM4C參與了對絲氨酸生物合成信號通路的激活過程;KDM4C蛋白可能是激活該通路的必不可少的一個蛋白。2.過表達KDM4C基因可轉(zhuǎn)錄激活絲氨酸生物合成信號通路進而促進腫瘤細胞的增殖較早的研究表明,KDM4C基因在人類多種腫瘤細胞系中都有異常的高表達。由于KDM4C是一個去甲基化酶,因此我們用誘導(dǎo)表達系統(tǒng)來研究其調(diào)控基因的機制。我們在細胞水平將KDM4C過表達后,發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞內(nèi)H3K9me3的整體水平明顯下降,而H3K9me1的整體水平明顯上調(diào),且H3K9me2的整體水平無明顯的變化。此外,KDM4C的過表達不僅提高了腫瘤細胞的增殖能力,還提高了其在動物體內(nèi)形成腫瘤的能力。這樣的現(xiàn)象有可能是KDM4C過表達后,對絲氨酸信號通路各基因的上調(diào)所導(dǎo)致的。我們通過在m RNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測這些基因,發(fā)現(xiàn)其都有一定程度上的提高。為了更準確的證實我們的推測,我們進一步地設(shè)計了Ch IP-q PCR實驗,其數(shù)據(jù)結(jié)果正如我們所料,KDM4C的過表達果然提高了其與PHGDH和PAST1啟動子DNA區(qū)域的結(jié)合度。這說明KDM4C對絲氨酸生物合成信號通路起著至關(guān)重要的作用,同時這也說明其在促進腫瘤細胞的增殖生長中也起著重要作用。3.KDM4C的表觀調(diào)控對腫瘤細胞氨基酸生物合成信號通路和運輸途徑的轉(zhuǎn)錄激活起著核心作用。由RNA Microarray基因芯片的分析,我們可以知道KDM4C在氨基酸生物合成和轉(zhuǎn)運的轉(zhuǎn)錄激活起著核心作用。為了驗證KDM4C與氨基酸合成的關(guān)系,我們利用RT-q PCR檢測與氨基酸合成相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)其顯著上調(diào),比如ASNS,ASS1,CTH,GOT1,GPT2等;而這些基因參與丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸和谷氨酸等相關(guān)氨基酸的生物合成。這也進一步驗證KDM4C確實參與了氨基酸生物合成的過程。同樣的,我們也發(fā)現(xiàn)SLC1A4,SLC1A5,SLC3A2,SLC6A9,SLC7A1,SLC7A5和SLC7A11等相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白基因也顯著性上調(diào);而這些基因幾乎涉及到了所有種類氨基酸的轉(zhuǎn)運過程,僅僅除了脯氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺這三種氨基酸。此外,Pedersen等人的Ch IP-seq實驗數(shù)據(jù)也顯示KDM4C與ASNS、ASS1、GPT2、SLC1A5和SLC7A1等基因的啟動子DNA區(qū)域有結(jié)合的峰值。以上兩個方面均證實KDM4C是氨基酸生物合成與轉(zhuǎn)運過程中一個重要的因子。除此之外,我們也做了氣相色譜-質(zhì)譜實驗,其數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示15個氨基酸的生物合成能力都有提高;而氨基酸的水平提高對激活m TOR1信號通路是最關(guān)鍵的一步。m TOR1通過刺激細胞內(nèi)高分子的生物合成以及生物周期進程來提高細胞的生長增殖能力的。這說明KDM4C在腫瘤細胞氨基酸的生物合成和轉(zhuǎn)運中起著核心作用。4.KDM4C需ATF4介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活絲氨酸生物合成途徑激活轉(zhuǎn)錄因子ATF4在細胞氨基酸缺乏應(yīng)答中起著關(guān)鍵的作用。而我們的結(jié)果數(shù)據(jù)顯示KDM4C可以直接上調(diào)或下調(diào)ATF4基因的m RNA水平或蛋白水平,且KDM4C可結(jié)合在ATF4的啟動子區(qū)域,這和Pedersen等人的研究是一致的;這說明KDM4C確實可以直接調(diào)控ATF4基因。緊接著我們研究了KDM4C對ATF4是否有生理學功能方面的作用。眾所周知,在氨基酸缺乏時,ATF4的表達可以特異性的升高。而我們的實驗發(fā)現(xiàn),當絲氨酸缺乏時KDM4C與ATF4的啟動子區(qū)域結(jié)合顯著性增加,與H3K9me3結(jié)合顯著性降低。當KDM4C被沉默后再進行絲氨酸缺乏實驗時,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATF4的m RNA水平和蛋白質(zhì)水平都沒有顯著性的上調(diào)。這說明在絲氨酸缺乏時,KDM4C是維持ATF4基因正常表達水平的關(guān)鍵因子之一。先前有報道顯示,ATF4可以直接調(diào)控絲氨酸合成通路基因PHGDH和PSAT1,于是我們推測ATF4可能是KDM4C的下游功能基因。因此我們先將KDM4C過表達然后再沉默ATF4,結(jié)果數(shù)據(jù)顯示沉默ATF4幾乎完全抑制了KDM4C促進腫瘤細胞增殖的能力,同時也幾乎完全抑制了KDM4C對絲氨酸生物合成信號通路基因的上調(diào)作用;更有趣的是,KDM4C和ATF4與絲氨酸生物合成信號通路基因PHGDH啟動子區(qū)域的結(jié)合也下降了,而H3K9me3與PHGDH啟動子區(qū)域的結(jié)合卻又顯著性的升高。于是我們推測ATF4與KDM4C可能是結(jié)合在一起共同地發(fā)揮生物學功能,接著我們做了ATF4和KDM4C的Co-IP實驗,結(jié)果顯示它們確實是結(jié)合在一起的。這說明在絲氨酸缺乏的情況下,KDM4C和ATF4結(jié)合在一起對絲氨酸生物合成信號通路基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2

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