【摘要】：表觀遺傳學(xué)是涉及基因表達(dá)可遺傳的變化但DNA序列未改變的研究。表觀遺傳調(diào)控的機(jī)制包括DNA和組蛋白修飾,染色體重組及無編碼RNA等�，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)顯示表觀遺傳的異常調(diào)控是促進(jìn)腫瘤發(fā)生的原動(dòng)力之一。眾所周知,腫瘤細(xì)胞通過重編程細(xì)胞內(nèi)代謝來滿足其生長(zhǎng)和增殖所需要的大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。細(xì)胞代謝重編程不僅改變了細(xì)胞命運(yùn),還改變了普通細(xì)胞的代謝途徑:有氧糖酵取代了正常的有氧呼吸和糖酵解途徑,將其從產(chǎn)生能量的分解代謝通路轉(zhuǎn)變?yōu)樯锖铣赏?進(jìn)而為氨基酸,核酸和脂類等的生物合成提供了原料,進(jìn)一步滿足了細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的合成代謝需要。而我們的前期研究顯示KDM4C在腫瘤細(xì)胞命運(yùn)和細(xì)胞代謝重編程中起著重要作用,且其在多種腫瘤細(xì)胞中都是基因擴(kuò)增和高表達(dá)的,包括淋巴瘤(lymphoma),乳腺癌(breast cancer),食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma),肺肉瘤樣癌(lung sarcomatoid carcinoma)和人髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma)。因此針對(duì)KDM4C的研究,有利于我們認(rèn)清組蛋白甲基化修飾表觀調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)和代謝重編程的分子機(jī)制,為治療腫瘤相關(guān)疾病提供一些藥物靶標(biāo)的參考。本論文對(duì)組蛋白去甲基化酶KDM4C主導(dǎo)的協(xié)調(diào)氨基酸代謝和細(xì)胞周期進(jìn)程之間聯(lián)系的表觀遺傳學(xué)機(jī)制進(jìn)行了探究;同時(shí)發(fā)現(xiàn)了KDM4C與轉(zhuǎn)錄激活因子ATF4之間的關(guān)系。這些結(jié)果都揭示了KDM4C在腫瘤形成及擴(kuò)張中具有一些新的生物學(xué)功能,其結(jié)論如下所示:1.KDM4C基因?qū)τ诮z氨酸生物合成信號(hào)通路基因的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的增殖是必須的在細(xì)胞水平將KDM4C基因沉默后,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)H3K9me3的整體水平明顯上調(diào);而同為KDM4家族的具有相似功能的其他基因的m RNA表達(dá)水平無明顯的增加,這說明KDM4C對(duì)H3K9me3的去甲基化是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過程,且沉默KDM4C對(duì)其他KDM4家族基因無明顯的影響。此外,沉默KDM4C明顯地抑制了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和形成細(xì)胞克隆的能力,這和Cloos et al.,Kim et al.等人的結(jié)果一致。另外,我們對(duì)BE(2)-C細(xì)胞進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),,并做了Ch IP-q PCR;結(jié)果顯示,KDM4C可結(jié)合在絲氨酸生物合成通路中的某些基因的啟動(dòng)子區(qū)域。我們將Pedersen et al.等人在人類食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(human esophageal squamous cell carcinoma)KYSE150中沉默KDM4C的Ch IP-seq數(shù)據(jù)結(jié)果與人類基因組進(jìn)行了比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)絲氨酸生物合成信號(hào)通路基因位點(diǎn)下均有較大峰值(peak)出現(xiàn),這與我們Ch IP-q PCR數(shù)據(jù)結(jié)果一致。由此可說明KDM4C對(duì)這些基因都有激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。換而言之,KDM4C對(duì)絲氨酸合成信號(hào)通路的激活起著重要的作用�？傊�,我們的數(shù)據(jù)證實(shí)至少在表觀遺傳調(diào)控被激活時(shí)期,KDM4C參與了對(duì)絲氨酸生物合成信號(hào)通路的激活過程;KDM4C蛋白可能是激活該通路的必不可少的一個(gè)蛋白。2.過表達(dá)KDM4C基因可轉(zhuǎn)錄激活絲氨酸生物合成信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖較早的研究表明,KDM4C基因在人類多種腫瘤細(xì)胞系中都有異常的高表達(dá)。由于KDM4C是一個(gè)去甲基化酶,因此我們用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)來研究其調(diào)控基因的機(jī)制。我們?cè)诩?xì)胞水平將KDM4C過表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)H3K9me3的整體水平明顯下降,而H3K9me1的整體水平明顯上調(diào),且H3K9me2的整體水平無明顯的變化。此外,KDM4C的過表達(dá)不僅提高了腫瘤細(xì)胞的增殖能力,還提高了其在動(dòng)物體內(nèi)形成腫瘤的能力。這樣的現(xiàn)象有可能是KDM4C過表達(dá)后,對(duì)絲氨酸信號(hào)通路各基因的上調(diào)所導(dǎo)致的。我們通過在m RNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)這些基因,發(fā)現(xiàn)其都有一定程度上的提高。為了更準(zhǔn)確的證實(shí)我們的推測(cè),我們進(jìn)一步地設(shè)計(jì)了Ch IP-q PCR實(shí)驗(yàn),其數(shù)據(jù)結(jié)果正如我們所料,KDM4C的過表達(dá)果然提高了其與PHGDH和PAST1啟動(dòng)子DNA區(qū)域的結(jié)合度。這說明KDM4C對(duì)絲氨酸生物合成信號(hào)通路起著至關(guān)重要的作用,同時(shí)這也說明其在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)中也起著重要作用。3.KDM4C的表觀調(diào)控對(duì)腫瘤細(xì)胞氨基酸生物合成信號(hào)通路和運(yùn)輸途徑的轉(zhuǎn)錄激活起著核心作用。由RNA Microarray基因芯片的分析,我們可以知道KDM4C在氨基酸生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)錄激活起著核心作用。為了驗(yàn)證KDM4C與氨基酸合成的關(guān)系,我們利用RT-q PCR檢測(cè)與氨基酸合成相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)其顯著上調(diào),比如ASNS,ASS1,CTH,GOT1,GPT2等;而這些基因參與丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸和谷氨酸等相關(guān)氨基酸的生物合成。這也進(jìn)一步驗(yàn)證KDM4C確實(shí)參與了氨基酸生物合成的過程。同樣的,我們也發(fā)現(xiàn)SLC1A4,SLC1A5,SLC3A2,SLC6A9,SLC7A1,SLC7A5和SLC7A11等相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因也顯著性上調(diào);而這些基因幾乎涉及到了所有種類氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)過程,僅僅除了脯氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺這三種氨基酸。此外,Pedersen等人的Ch IP-seq實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示KDM4C與ASNS、ASS1、GPT2、SLC1A5和SLC7A1等基因的啟動(dòng)子DNA區(qū)域有結(jié)合的峰值。以上兩個(gè)方面均證實(shí)KDM4C是氨基酸生物合成與轉(zhuǎn)運(yùn)過程中一個(gè)重要的因子。除此之外,我們也做了氣相色譜-質(zhì)譜實(shí)驗(yàn),其數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示15個(gè)氨基酸的生物合成能力都有提高;而氨基酸的水平提高對(duì)激活m TOR1信號(hào)通路是最關(guān)鍵的一步。m TOR1通過刺激細(xì)胞內(nèi)高分子的生物合成以及生物周期進(jìn)程來提高細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力的。這說明KDM4C在腫瘤細(xì)胞氨基酸的生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)中起著核心作用。4.KDM4C需ATF4介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活絲氨酸生物合成途徑激活轉(zhuǎn)錄因子ATF4在細(xì)胞氨基酸缺乏應(yīng)答中起著關(guān)鍵的作用。而我們的結(jié)果數(shù)據(jù)顯示KDM4C可以直接上調(diào)或下調(diào)ATF4基因的m RNA水平或蛋白水平,且KDM4C可結(jié)合在ATF4的啟動(dòng)子區(qū)域,這和Pedersen等人的研究是一致的;這說明KDM4C確實(shí)可以直接調(diào)控ATF4基因。緊接著我們研究了KDM4C對(duì)ATF4是否有生理學(xué)功能方面的作用。眾所周知,在氨基酸缺乏時(shí),ATF4的表達(dá)可以特異性的升高。而我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)絲氨酸缺乏時(shí)KDM4C與ATF4的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合顯著性增加,與H3K9me3結(jié)合顯著性降低。當(dāng)KDM4C被沉默后再進(jìn)行絲氨酸缺乏實(shí)驗(yàn)時(shí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATF4的m RNA水平和蛋白質(zhì)水平都沒有顯著性的上調(diào)。這說明在絲氨酸缺乏時(shí),KDM4C是維持ATF4基因正常表達(dá)水平的關(guān)鍵因子之一。先前有報(bào)道顯示,ATF4可以直接調(diào)控絲氨酸合成通路基因PHGDH和PSAT1,于是我們推測(cè)ATF4可能是KDM4C的下游功能基因。因此我們先將KDM4C過表達(dá)然后再沉默ATF4,結(jié)果數(shù)據(jù)顯示沉默ATF4幾乎完全抑制了KDM4C促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的能力,同時(shí)也幾乎完全抑制了KDM4C對(duì)絲氨酸生物合成信號(hào)通路基因的上調(diào)作用;更有趣的是,KDM4C和ATF4與絲氨酸生物合成信號(hào)通路基因PHGDH啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合也下降了,而H3K9me3與PHGDH啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合卻又顯著性的升高。于是我們推測(cè)ATF4與KDM4C可能是結(jié)合在一起共同地發(fā)揮生物學(xué)功能,接著我們做了ATF4和KDM4C的Co-IP實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示它們確實(shí)是結(jié)合在一起的。這說明在絲氨酸缺乏的情況下,KDM4C和ATF4結(jié)合在一起對(duì)絲氨酸生物合成信號(hào)通路基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：2399518