【摘要】：背景股骨頭壞死是一種骨科常見病,發(fā)病率高,致殘率高,其發(fā)病機制尚不明確,但各種學(xué)說的共同點是,不同病因造成的股骨頭血供障礙是股骨頭壞死的主要病理機制。股骨頭壞死的治療重點是早期發(fā)現(xiàn)和早期治療,在股骨頭塌陷之前采取措施改善股骨頭血供,促進(jìn)骨再生,從而阻止病情進(jìn)展或逆轉(zhuǎn)病程。因此在股骨頭壞死的修復(fù)中,獲得良好的結(jié)構(gòu)支撐和骨組織再生是治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。髓芯減壓術(shù)結(jié)合生物材料植入是最佳方案之一,可以清除壞死組織,延緩股骨頭壞死的進(jìn)展,促進(jìn)骨再生。鈦合金具有良好的力學(xué)性能和生物相容性,是臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛使用的材料之一。通過構(gòu)建多孔結(jié)構(gòu)的支架,可以使股骨頭內(nèi)獲得力學(xué)支撐,而且整體材料的彈性模量接近人體骨組織,降低應(yīng)力屏蔽效應(yīng),為骨組織再生提供良好的微環(huán)境。VEGF具有強大的促內(nèi)皮增殖、促血管生成、再血管化的作用,在體外可以促使BMSC向成骨方向分化。殼聚糖是一種無毒、生物相容性好、在體內(nèi)可降解的理想的藥物載體。因此,我們使用3D打印技術(shù)制備多孔鈦支架,再復(fù)合以包裹VEGF的殼聚糖微球,然后在體外驗證其促成骨能力,并在兔體內(nèi)驗證其治療股骨頭壞死的效果。方法首先使用3D打印技術(shù)制備高孔隙率、具有良好生物相容性的多孔鈦支架,再使用離子交聯(lián)法制備包裹VEGF的殼聚糖微球,將二者凍干復(fù)合,制得富含VEGF的殼聚糖微球復(fù)合多孔鈦支架。在體外檢測支架緩釋VEGF的效果。將支架與BMSC共培養(yǎng),使用CCK-8法檢測支架對BMSC增殖的影響,使用real-time PCR方法檢測成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)量,使用ALP染色和茜素紅染色研究細(xì)胞ALP的活性和鈣沉積情況。構(gòu)建兔股骨頭壞死模型,將支架植入兔股骨頭內(nèi),于術(shù)后1個月、2個月和3個月時,對兔的體重、步態(tài)進(jìn)行評估,使用microCT對兔股骨頭進(jìn)行影像學(xué)評價,使用硬組織切片和Masson三色染色法對股骨頭進(jìn)行組織學(xué)評價,分析骨再生的情況,并與陽性對照組(髓芯減壓術(shù)結(jié)合自體植骨)和模型組進(jìn)行對比。結(jié)果1.復(fù)合支架制備和緩釋性能研究:成功制備出富含VEGF的殼聚糖微球復(fù)合多孔鈦支架。用于細(xì)胞培養(yǎng)的支架為圓柱體,直徑為0.9cm,高度為0.5cm;用于動物實驗的支架為圓柱體,直徑為0.3cm,長度為2.5cm。掃描電鏡觀察可見,支架表面被殼聚糖微球覆蓋,微球直徑在30μm左右。ELISA結(jié)果顯示,支架在21天內(nèi)平穩(wěn)釋放VEGF,總釋放量達(dá)0.42μg,是總載藥量的84%,顯著高于對照組(p0.05)。2.復(fù)合支架促進(jìn)BMSC成骨分化的體外實驗:以BMSC與支架共培養(yǎng)為實驗組,以僅用培養(yǎng)基為對照組。CCK-8實驗結(jié)果顯示,在BMSC培養(yǎng)24小時、48小時,實驗組與對照組的吸光度值相似(0.40±0.05 vs 0.38±0.04,0.68±0.03 vs 0.60±0.03,p0.05);培養(yǎng)72小時后,實驗組吸光度值高于對照組(1.11±0.08vs0.90±0.01,p0.05)。Real-time PCR結(jié)果顯示,培養(yǎng)3天、6天和12天以后,實驗組ALP、BSP、OCN和CollagenⅠ基因表達(dá)量均高于同期對照組(p0.05)。ALP染色結(jié)果顯示,在培養(yǎng)6天和12天后,實驗組ALP染色的陽性率顯著高于同期對照組染色的陽性率。茜素紅染色結(jié)果顯示,在培養(yǎng)6天和12天后,實驗組鈣結(jié)節(jié)的密度顯著高于同期對照組。3.支架治療兔股骨頭壞死的體內(nèi)實驗:將支架植入兔體內(nèi)后,兔的睡眠、進(jìn)食未受明顯影響,實驗組步態(tài)較模型組顯著改善,與陽性對照組相似。microCT結(jié)果顯示,實驗組的支架周圍及支架內(nèi)部有骨小梁形成,隨著時間延長,骨小梁量增加,排列趨于規(guī)則;模型組無明顯骨小梁再生;陽性對照組的情況與實驗組類似。定量分析表明,術(shù)后2個月和3個月時,實驗組股骨頭區(qū)的骨量開始明顯高于模型組(0.56±0.06vs0.41±0.003,p0.05),和陽性對照組相似(0.56±0.06vs0.57±0.05)。病理切片結(jié)果顯示,實驗組可在支架周圍見骨小梁新生,內(nèi)含豐富的骨陷窩和骨細(xì)胞,隨著時間延長,膠原趨于成熟;陽性對照組亦可見到明顯的骨小梁再生,且隨著時間延長,植骨區(qū)的界線逐漸模糊消失;模型組未見明顯的骨再生。結(jié)論富含VEGF的殼聚糖微球復(fù)合3D打印鈦金屬多孔支架可以有效促進(jìn)BMSC增殖和成骨分化,可有效治療實驗性兔股骨頭壞死,且對細(xì)胞和動物沒有毒性,具有較好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R681.8

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本文編號：2398230