【摘要】：目的:P-糖蛋白(p-gp)是腫瘤多藥耐藥發(fā)生的主要因素,目前尚無理想的抑制藥物。為研究多種萜類化合物對p-gp的抑制作用,本文從藥-藥相互作用的角度進行藥效探討、并從p-gp轉(zhuǎn)運活性、蛋白和基因表達、細胞能量供給、藥物動力學(xué)等方面進行機制研究,最后還結(jié)合分子模擬進行分析,為其開發(fā)提供依據(jù)。方法:本論文首先通過研究多種萜類成分與鹽酸米托蒽醌的聯(lián)合給藥,篩選出具有協(xié)同增敏作用的候選活性成分;然后通過探討候選活性成分對p-pg的轉(zhuǎn)運活性、蛋白和基因表達、細胞ATP酶活性的影響,探討活性成分對P-gp影響的環(huán)節(jié);通過分析口服給藥活性萜類化合物對P-gp底物的藥物動力學(xué)參數(shù)改變,探討其影響體內(nèi)P-gp對藥物口服吸收的作用;最后結(jié)合計算機分子模擬,探討候選萜類成分與P-gp結(jié)合的分子機制。其具體步驟如下:1.以人源子宮肉瘤細胞非耐藥細胞株MES-SA以及其耐藥細胞株MES-SA/MX2細胞為研究對象,觀察細胞的生長形態(tài),并結(jié)合細胞生長曲線的分析,確定后續(xù)實驗采用的細胞密度范圍;通過比較非耐藥細胞株與耐藥細胞株P(guān)-gp蛋白及基因表達、轉(zhuǎn)運活性等,確證所選用細胞為P-gp耐藥機制的細胞株。2.以MTT檢測法確定萜類成分對MES-SA/MX2細胞的增殖抑制作用,確定萜類成分的試驗劑量。3.采用MTT法測定萜類成分和不同濃度的鹽酸米托蒽醌聯(lián)合給藥后對MES-SA/MX2細胞的生長抑制率,并計算出IC50和耐藥倍數(shù),篩選出具有協(xié)同增效作用的萜類化合物作為逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥作用的候選萜類活性成分。4.以P-gp熒光探針四甲基羅丹明甲酯(TMRM)作為底物,采用流式細胞術(shù)檢測候選活性萜類成分給藥后MES-SA/MX2細胞的TMRM熒光強度,探討萜類成分對P-gp轉(zhuǎn)運功能的影響。5.分別采用蛋白印跡法(WB)法和實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法測定候選活性萜類活性成分對MES-SA/MX2細胞中P-gp的蛋白和基因MDR1表達,探討候選萜類成分對P-gp表達的影響。6.使用ATP酶試劑盒,測定候選活性萜類成分對MES-SA/MX2細胞ATP酶的活性影響,探討候選活性萜類成分對細胞能量供給的影響。7.使用SD大鼠進行藥物動力學(xué)實驗,測定活性萜類成分對葛根素的藥物動力學(xué)影響,探討萜類成分對P-gp底物的體內(nèi)吸收影響。8.選用計算機分子模擬方法,研究活性萜類成分與P-gp蛋白的分子對接,并與已知的抑制劑的結(jié)合氨基酸位點比較,總結(jié)活性萜類分子逆轉(zhuǎn)P-gp外排作用的結(jié)合情況。結(jié)果:1.根據(jù)MES-SA和MES-SA/MX2的驗證實驗結(jié)果,MES-SA細胞的生長形態(tài)為梭形,貼壁性好;而MES-SA/MX2細胞的形態(tài)主要為圓形,部分為梭形,貼壁性較差。鹽酸米托蒽醌對兩種細胞的增殖抑制影響明顯不同,鹽酸米托蒽醌對MES-SA細胞的IC50為 1.23 uM,而對 MES-SA/MX2 細胞的 IC50為 97.5 μM,顯示 MES-SA/MX2 細胞的耐藥性明顯高于MES-SA細胞。WB和RT-qPCR結(jié)果顯示,MES-SA細胞幾乎不表達P-gp,而MES-SA/MX2細胞大量表達P-gp。陽性對照藥物維拉帕米能下調(diào)P-gp蛋白表達。熒光結(jié)果顯示MES-SA細胞比MES-SA/MX2細胞具有更強烈的TMRM熒光,流式細胞術(shù)結(jié)果表明MES-SA/MX2細胞的P-gp外排能力比MES-SA細胞更強。綜合以上實驗結(jié)果,表明MES-SA/MX2細胞具有更強的耐藥性,其原因是由P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥性造成的。2.根據(jù)各萜類化合物對MES-SA/MX2細胞的MTT實驗結(jié)果,各化合物對細胞的增殖抑制作用不同,選擇低于IC20的試驗藥物濃度進行后續(xù)的聯(lián)合用藥實驗。本實驗最終選擇用于聯(lián)合實驗的萜類化合物濃度分別為:①單萜類:艾片(10 μM、50μM),天然冰片(10 μM、50 μM),合成冰片(10 μM、50 μM),芍藥苷(20μM)。②倍半萜類:青蒿素(20 μM),雙氫青蒿素(20 μM),廣藿香醇(20μM)。③二萜類:穿心蓮內(nèi)酯(5 μM、20 μM),異穿心蓮內(nèi)酯(20 μM、50μM),穿心蓮酸(20 pM、50 μM),脫水穿心蓮內(nèi)酯(20 μM、50 μM),脫水穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉(20 μM、50 μM)。④三萜類:人參皂苷Rb1(20 μM),人參皂苷Rb3(20 μM),人參皂苷Rh1(20 μM),人參皂苷Rh2(20 μM),人參皂苷Rd(20 μM),人參皂苷Rc(20 μM),三七皂苷Rb1(20 μM),三七總皂苷(20μM),柴胡皂苷A(5 uM),柴胡皂苷B2(5 μM),柴胡皂苷C(5 uM),柴胡皂苷D(2 μM),齊墩果酸(5 μM)、熊果酸(5 μM)、甘草次酸(5 pM)、白樺脂酸(5 μM)、吳茱萸內(nèi)酯(5 μM)、川續(xù)斷皂苷Ⅵ(5 μM)、絞股藍皂苷(5μ M)。3.萜類化合物的增敏作用研究:非耐藥細胞的耐藥倍數(shù)為1.00,耐藥細胞的耐藥倍數(shù)為79.39,陽性對照維拉帕米的耐藥倍數(shù)為4.16,顯示出顯著的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用。通過實驗得到降低細胞耐藥倍數(shù)的候選活性成分及對應(yīng)濃度的結(jié)果如下:①單萜類:艾片低高濃度(10 μM、50 μM)的耐藥倍數(shù)分別為27.33和9.66、天然冰片低高濃度(10 μM、50 μM)的耐藥倍數(shù)分別為65.89和15.72、合成冰片低高濃度(10 μM、50 μM)的耐藥倍數(shù)分別為78.74和22.81。②二萜類:穿心蓮內(nèi)酯5 uM的耐藥倍數(shù)為56.27、異穿心蓮內(nèi)酯20 μM的耐藥倍數(shù)為37.41、脫水穿心蓮內(nèi)酯20 μM的耐藥倍數(shù)為35.02、脫水穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉20 μM的耐藥倍數(shù)為37.30。4.P-pg轉(zhuǎn)運活性實驗以候選活性成分影響TMRM的細胞熒光強度來評價,以空白組的相對熒光強度為100%,陽性對照藥物維拉帕米能顯著提高TMRM的胞內(nèi)熒光強度,當濃度大于50 μM后,TMRM熒光強度趨于穩(wěn)定,相對熒光強度達到172.1%。候選的萜類化合物的相對熒光強度結(jié)果顯示:①單萜類:艾片低中高濃度(1,10,50μM)分別為 111.5%(P0.01),116.2%(P0.01),123.0%(P0.01);天然冰片低中高濃度(1,10,50 μM)分別為 100.0%,104.5%(P0.01),104.7%(P0.01);合成冰片低中高濃度(1,10,50 μM)分別為 103.3%(P0.05),103.9%(P0.01),104.2%(P0.01)。②二萜類:穿心蓮內(nèi)酯系列濃度(1,10,25,50,100 μM)分別為100.8%,101.4%,106.5%(P0.05),107.9%(P0.05),108.0%(P0.05);異穿心蓮內(nèi)酯系列濃度(1,10,25,50,100 μM)分別為 98.9%,98.7%,104.0%(P0.05),104.4%(0.05),122.9.0%(P0.01)。脫水穿心蓮內(nèi)酯系列濃度(1,10,25,50,100 μM)分別為 103.9%,104.0%,113.1%(P0.01),122.6%(P0.01),148.8%(P0.01);脫水穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉系列濃度(1,10,25,50,100 μM)分別為 101.1%,102.6%,110.0%(P0.01),108.5%(P0.05),115.7%(P0.01);5.候選活性成分對P-gp蛋白表達影響結(jié)果:空白對照組的表達量為100%。①單萜類:艾片低中高濃度(10,20,50 μM)的P-gp表達量分別為71.6(P0.01),90.4%(P0.05),114.5%;天然冰片低中高濃度(10,20,50 μM)的P-gp表達量分別為 78.9%(P0.05),74.4%(P0.05),70.7%(P0.05);合成冰片低中高濃度(10,20,50 μM)的 P-gp 表達量分別為 66.2%(P0.01),79.0%(P0.05),97.8%。②二萜類:穿心蓮內(nèi)酯低中高濃度(1,5,10 μM)的P-gp表達量分別為87.4%(P0.05),68.5%(P0.01),40.7%(P0.01);異穿心蓮內(nèi)酯低中高濃度(1,10,100 μM)的 P-gp 表達量分別為 74.5%(P0.01),76.4%(0.01),81.8%(P0.01);脫水穿心蓮內(nèi)酯低中高濃度(1,10,100 μM)的P-gp表達量分別為86.1%,85.0%(P0.05),70.2%(P0.05);脫水穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉低中高濃度(1,10,100 μM)的 P-gp 表達量分別為 98.2%,97.6%,127.2%。6.候選活性成分對MDR1表達結(jié)果:以空白對照組的MDR1表達量為100%。①單萜類:艾片20 μM、天然冰片20 μM、合成冰片20 μM的表達量為82.1%(P0.01),101.4%,95.3%(P0.01)。②二萜類:穿心蓮內(nèi)酯5 μM、異穿心蓮內(nèi)酯20 μM、穿心蓮酸20 μM、脫水穿心蓮內(nèi)酯20 μM、脫水穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉20 M的表達量為 94.7%(P0.01),83.1%(P0.01),97.2%,91.0%,93.6%。7.ATP酶試劑盒測定活性成分對細胞的ATP酶活性結(jié)果:空白對照組的酶活力為1.0494 U/mgProt。①單萜類:艾片的低中高濃度(10,20,50 μM)的ATP酶活性分別為 0.9376(P0.05),0.9402(P0.05),0.9322(P0.05)U/mgProt。天然冰片的低中高濃度(10,20,50 μM)的ATP酶活性分別為1.084,1.066,0.9665(P0.05)U/mgProt。合成冰片的低中高濃度(10,20,50 μM)的ATP酶活性分別為 1.087,0.9874,0.9348(P0.05)U/mgProt。②二萜類:穿心蓮內(nèi)酯 5 μM,異穿心蓮內(nèi)酯20 μM,穿心蓮酸20 μM,脫水穿心蓮內(nèi)酯20 μM,脫水穿心蓮內(nèi)酯亞硫酸氫鈉 20 μM 分別為:0.9786(P0.05),1.0904,1.0383,1.1006,1.0520 U/mgprot。8.綜合細胞水平的藥效結(jié)果,選擇了互為空間異構(gòu)體的部分冰片類成分和穿心蓮內(nèi)酯等成分在大鼠上進行藥物動力學(xué)實驗,考察對P-gp底物葛根素的藥物動力學(xué)影響。結(jié)果顯示:①單萜類的艾片的作用比天然冰片強:艾片(100 mg ·Kg-1)能夠升高葛根素的AU(C(0-t)達71.9%(P0.01)、AUC(0-∞)達62.4%、提高Cmax提高374.4%(P0.05),縮短其 Tmax 達 50%(P0.05)、CLz/F 顯著降低 24.3%(P0.05);天然冰片(100 mg· Kg-1）對葛根素的Cmax存在一定程度的升高,縮短其Tmax時間,體現(xiàn)其影響葛根素吸收的作用,但與空白對照組比較無統(tǒng)計差異,且其作用不如艾片組的明顯。②二萜類的穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯作用比異穿心蓮內(nèi)酯作用強:穿心蓮內(nèi)酯(60 mg · kg-1)和脫水穿心蓮內(nèi)酯(60 mg · Kg-1)能夠升高葛根素的AUC(0-t)分別為 30.7%和 27.3%、AUC(0-∞)分別為 27.2%和 67.3%(P0.05),提高 Cmax 分別為11.5%(P0.05)和26.9%(P0.05);異穿心蓮內(nèi)酯(60 mg· Kg-1)降低葛根素的AUC(0-∞)下降為對照組的71.4%,MRT(0-∞)下降40.2%,Tmax延遲332.7%(P0.01)。9.利用分子模擬技術(shù),建立合理的人源P-gp蛋白結(jié)構(gòu)。將底物、抑制劑與候選萜類分子跟P-gp蛋白上定義的兩個結(jié)合口袋SBD1和SBD2進行分子對接并對氨基酸結(jié)合位點分析,發(fā)現(xiàn)P-gp跨膜區(qū)上的TM1、TM5、TM6、TM7、TM11和TM12等螺旋鏈參與配體對接的主要部分,其中MET192、GLN195、SER196、THR199、ILE306、TYR307、TYR310、PHE336、LEU339、ILE340、PHE343、SER344、GLN347、GLN725、PR0726、PHE728、ALA729、PHE732、PHE759、GLN946、MET949、TYR950、TYR953、IEU975、PHE978、SER979、VAL982、PHE983、MET986、MET68、MET69、LEU65 為對接頻次最多的氨基酸。結(jié)論:1.艾片(左旋龍腦)、天然冰片(右旋龍腦)、合成冰片(消旋體龍腦)能夠抑制P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥作用,主要是影響P-gp蛋白表達和抑制其轉(zhuǎn)運活性。這與其空間結(jié)構(gòu)有關(guān),體外和體內(nèi)實驗均顯示左旋結(jié)構(gòu)(艾片)比右旋結(jié)構(gòu)(天然冰片)顯示出更強的抑制活性。2.穿心蓮成分中的5個結(jié)構(gòu)顯示了不同程度的P-gp抑制作用。穿心蓮內(nèi)酯和異穿心蓮內(nèi)酯內(nèi)酯互為立體異構(gòu)體,兩種主要是影響了 P-gp的蛋白表達和轉(zhuǎn)運功能,穿心蓮內(nèi)酯顯示出更佳的P-gp抑制效果,其可以影響細胞的ATP酶活性,在體的研究更顯示穿心蓮內(nèi)酯比異穿心蓮內(nèi)酯對底物的影響更加明顯,說明空間結(jié)構(gòu)的差異是兩者表現(xiàn)出不同P-gp抑制程度的主要影響因素。脫水穿心蓮內(nèi)酯是5個穿心蓮結(jié)構(gòu)中影響p-gp作用最為明顯的,其可能是對抑制p-gp的表達,轉(zhuǎn)運活性等有關(guān)。3.分子模擬的結(jié)果顯示P-gp抑制劑及底物與P-gp跨膜區(qū)上的TM1、TM5、TM6、TM7、TM11和TM12等螺旋鏈上部分氨基酸結(jié)合有密切關(guān)系,而實驗中候選萜類化合物對這些氨基酸同樣存在結(jié)合作用,因此研究這些結(jié)合位點與化合物的結(jié)合情況,有利于萜類P-gp抑制劑的篩選。綜上所述,冰片等多種萜類化合物具有逆轉(zhuǎn)P-gp活性的作用,但作用途徑不盡相同,作用機制與其與P-gp空間結(jié)合能力有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2367007