【摘要】：背景:microRNAs(miRNAs)是一類小的非編碼RNAs群,其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控著相關(guān)基因的表達。microRNA-155(miR-155)是一種典型的多功能miRNA,其在機體代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。為了深入研究miR-155的功能及其特點,十分需要建立其相關(guān)的基因敲除模型。目前,國內(nèi)尚未見自主設(shè)計建立miR-155基因敲除小鼠模型的報道。近年來,隨著基因篩查及修飾技術(shù)的革新,CRISPR/Cas 9技術(shù)現(xiàn)已作為一種常用有效的技術(shù)手段應用于基因研究中。在基因研究的動物實驗中,基因敲除模型或者轉(zhuǎn)基因動物模型也已經(jīng)被廣泛地應用。本實驗旨在利用CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建microRNA-155基因敲除小鼠模型,并進而建立純合子繁育體系。目的:利用CRISPR/Cas 9技術(shù),構(gòu)建miR-155基因敲除小鼠模型。方法:選擇健康C57BL/6J小鼠,首先提取小鼠DNA并進行全基因組的擴增和測序,予以明確miR-155序列及位點;針對miR-155的結(jié)構(gòu)特點,設(shè)計并構(gòu)建Cas 9載體質(zhì)粒(Cas9RNA)及打靶載體(sgRNA);隨后將體外轉(zhuǎn)錄后的Cas9mRNAs及sgRNA,顯微注射入小鼠的受精卵,并將受精卵進行體外培養(yǎng);將培養(yǎng)合格的胚胎移植到代孕小鼠的輸卵管中,待代孕小鼠生育后得到F0代小鼠;通過對F0代小鼠進行DNA提取及基因型檢測,確定基因敲除情況,進而建立并繁育miR-155基基因敲除小鼠模型純合子體系。結(jié)果:實驗共收集112個小鼠受精卵進行顯微注射,發(fā)育良好形成胚胎的共94個;經(jīng)sgRNA活性檢測后,合格的胚胎共81個,隨后將其移植到5只受孕小鼠體內(nèi);5只小鼠經(jīng)21天左右分娩,共生育18只小鼠,其中1只死亡,余存活小鼠進行DNA提取及基因型檢測分析;經(jīng)基因測序后,出現(xiàn)基因改變的小鼠共7只,其中6只小鼠只出現(xiàn)單鏈單個堿基缺失,只有4號小鼠出現(xiàn)DNA單鏈堿基片段缺失,缺失長度為114 bp;對其進行繁育后,發(fā)現(xiàn)其基因型可以穩(wěn)定傳代,得到F1代雜合子小鼠3只;雜合子小鼠回交繁育,得到F2代純合子基因敲除小鼠,并進行基因測序驗證:基因敲除小鼠缺失片段包含microRNA-155主基因,成功敲除miR-155基因序列。結(jié)論:CRISPR/Cas 9技術(shù)能夠快速、有效地構(gòu)建miR-155基因敲除小鼠模型;且miR-155基因敲除小鼠,在清潔級的動物飼養(yǎng)環(huán)境中可以正常繁育。背景:近年來,研究發(fā)現(xiàn)miR-155參與了機體多種生物學過程,例如:免疫反應、炎癥反應、病毒感染、腫瘤以及心血管疾病。尤其是在炎癥反應及免疫反應過程中,炎性細胞、淋巴T細胞和淋巴B細胞的發(fā)生發(fā)展與miR-155的表達具有密切的聯(lián)系。既往大量研究表明miR-155具有重要的生物學功能,但是在機體正常生理條件下,miR-155的生物學功能及特性研究尚未見報道。前期實驗我們利用CRISPR/Cas 9技術(shù),成功構(gòu)建了miR-155基因敲除小鼠模型,并建立了純合子體系�；谇捌趯嶒�,我們將miR-155基因敲除小鼠與正常C57BL/6野生型小鼠進行比較研究,旨在探索正常生理條件下,miR-155的生物學功能及特性。目的:利用基因敲除模型,比較研究miR-155生物學特性。方法:隨機選取miR-155基因敲除小鼠(KO組)與正常C57BL/6野生型小鼠(WT組),每組10只公鼠、10只母鼠,均8周齡,對其進行比較研究,包括:繁殖能力分析、生長曲線評估、腹部及心臟超聲檢查、血液學檢查以及病理組織學檢查。結(jié)果:我們對通過繁殖能力、生長曲線、超聲檢查、血液學檢查以及病理組織學檢查各項數(shù)據(jù)整理分析發(fā)現(xiàn),各組主要檢查指標均沒有顯著性差異。盡管在部分數(shù)據(jù)中出現(xiàn)了較大的差異,但在對照組與模型組組內(nèi)也呈現(xiàn)出同趨勢性變化,因此這些差異沒有統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果顯示:在正常的生理條件下,對照組及模型組小鼠的生長發(fā)育均呈正常狀態(tài),組間無差異。通過本實驗研究和總結(jié)近年來相關(guān)文獻,我們發(fā)現(xiàn)在正常生理條件下,miR-155是一種非必需基因,其缺失對小鼠的生長發(fā)育無明顯影響。結(jié)論:小鼠出生后42天期間,miR-155基因缺失對其生長曲線無明顯影響;8周齡小鼠的正常生理條件下,miR-155的缺失對小鼠的生長發(fā)育無明顯影響;因此,為了研究miR-155復雜的生物學功能,必須對miR-155基因敲除小鼠進行建模和干預。背景:糖尿病作為臨床上最常見的疾病,常常引起多種疾病及并發(fā)癥,例如眼底病變、神經(jīng)性病變及纖維化病變。心肌纖維化是最常見的纖維化疾病之一,其也是心臟疾病中重要的病理表現(xiàn)之一。心肌纖維化可導致致命性的心肌損傷,例如心功能不全,甚至心臟衰竭。但是目前臨床上缺少相應的靶向藥物可以預防或者治療心肌纖維化。既往研究表明,在心肌纖維化的進展中,膠原的合成和沉積是導致纖維化加重最主要的原因之一。據(jù)報道,高糖可以加速膠原的生成,進而加重纖維化程度,從而引起心肌損傷。miR-155是一種典型的多功能miRNAs,研究發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控了多種纖維化疾病過程。但是miR-155對心肌纖維化的影響機制尚未見報道。目的:探究miR-155在高糖所致心肌纖維化中的作用機制及其生物學功能。方法:我們選取miR-155基因敲除小鼠(KO組)與正常C57BL/6野生型小鼠(WT組)建立高糖模型(鏈脲佐菌素腹腔注射);建模后30天、60天行心臟超聲予以評估小鼠心功能情況;隨后進行病理組織學檢查(HE與天狼星紅染色)評估小鼠心肌損傷情況。此外,我們對正常C57BL/6野生型小鼠進行心臟原代成纖維細胞提取并進行miR-155的轉(zhuǎn)染(miR-155抑制、miR-155過表達及陰性對照),進而研究miR-155對心肌纖維化過程中的具體影響機制。結(jié)果:建模30天后,所有小鼠均存活,并進行心臟超聲檢查,結(jié)果顯示:僅正常高糖組小鼠出現(xiàn)輕微的心功能損傷,敲除高糖組未發(fā)現(xiàn)明顯心臟損傷;建模60天后,正常高糖組小鼠死亡3只小鼠,敲除高糖組死亡1只小鼠,余各組均存活,所有存活小鼠均進行心臟超聲檢查,結(jié)果顯示:糖尿病各組小鼠均出現(xiàn)顯著的心功能損傷,而且與正常高糖組相比,敲除高糖組心臟損傷程度明顯減輕。病理檢測(天狼星紅)結(jié)果顯示:對正常組相比,糖尿病組小鼠均出現(xiàn)Ⅰ型及Ⅲ型膠原的顯著增多;與敲除高糖組相比,正常高糖組細胞及組織間隙的膠原沉積程度明顯加重。另外,HE染色結(jié)果顯示:與敲除高糖組相比,正常高糖組心肌組織出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)損傷。細胞實驗結(jié)果顯示:經(jīng)高糖刺激后,與正常低糖組相比,正常高糖組出現(xiàn)明顯Ⅰ型膠原的高表達。miR-155過表達高糖組Ⅰ型膠原的表達量最高。同時,與正常高糖組相比,miR-155抑制高糖組Ⅰ型膠原的表達出現(xiàn)顯著的降低;另外,與正常組相比,TGF-β1、Smad2以及磷酸化的Smad2均在miR-155抑制時出現(xiàn)顯著的下調(diào),在miR-155過表達時出現(xiàn)了顯著的上升。結(jié)論:miR-155基因敲除后可以延緩高糖導致的心肌纖維化,并且miR-155可以通過TGF-β1-Smad 2信號通路調(diào)控心肌纖維化過程。研究表明,miR-155可能是治療高糖所致心臟纖維化的潛在作用靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R542.2

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本文編號：2368137