發(fā)布時(shí)間：2018-12-06 12:23

【摘要】：研究目的:明確自身抗原TGM3參與AD自身變態(tài)反應(yīng)發(fā)病的作用和機(jī)制研究?jī)?nèi)容:①TGMs的sIgE的水平及與特應(yīng)性皮炎病情相關(guān)性研究;②AD患者皮損表皮中TGM的mRNA和TGM3蛋白的表達(dá);③炎癥刺激下的角質(zhì)形成細(xì)胞的TGM的表達(dá);④TGM3與CD209的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn);⑤TGM3對(duì)外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞(MDDC)的活化能力研究;⑥TGM3對(duì)T細(xì)胞亞群分化的影響。研究方法:①聯(lián)合使用免疫捕獲法和生物素標(biāo)記的酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)77例AD患者(包括44例青少年及成人、33例嬰兒及兒童)、40例成人尋常性銀屑病和30例成人健康對(duì)照者的血清中TGMs的sIgE的表達(dá),并與病情進(jìn)行相關(guān)性分析。②用qRT-PCR方法和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)AD皮損表皮中的TGM基因mRNA的表達(dá)和TGM3蛋白的表達(dá)。③采用qRT-PCR方法檢測(cè)炎癥刺激狀況下角質(zhì)形成細(xì)胞中TGM的表達(dá)。④聯(lián)用qRT-PCR方法和流式技術(shù)檢測(cè)CD209siRNA后CD209的表達(dá)情況。采用ELISA方法和激光共聚焦顯微鏡和流式技術(shù)檢測(cè)CD209與TGM3的結(jié)合能力。⑤用流式細(xì)胞儀和CBA小球分別檢測(cè)TGM3刺激后的MDDC表面分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86 的表達(dá)情況和細(xì)胞上清中 IL-6、IL-1 β、IL-8、IL-10、TNF、IL-12p70的表達(dá)。⑥將初始T細(xì)胞與TGM3-MDDC共培養(yǎng)5天,用流式技術(shù)和CBA小球檢測(cè)TGM3對(duì)T細(xì)胞亞群分化的影響及培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ、IL-17A的表達(dá)。研究結(jié)果:①青少年及成人AD組、成人尋常性銀屑病組TGMs的sIgE水平均顯著高于成人健康對(duì)照組(χ 2值=37.12和15.88,P值均0.001)。內(nèi)源性AD組TGMs sIgE水平比外源性AD組升高(t=2.27,P=0.02)。AD患者組TGMs sIgE水平與患者年齡、病程、SCORAD評(píng)分、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清總IgE無顯著相關(guān)性(r=0.03,0.14,-0.04,-0.08 和 0.06,P=0.78,0.24,0.74,0.54 和 0.62)。②AD組皮損表皮中TGM3和TGM5的mRNA表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組(P=0.001和0.01)。AD患者皮損表皮中TGM3蛋白的表達(dá)水平比健康對(duì)照表皮明顯升高。③ HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 Derp 10ug/ml,TSLP20ng/ml 刺激 12h、24h、36h后,TGM1表達(dá)均比空白對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.01)。加入IL-1β 1Ong/ml和50ng/ml刺激24h后,TGM1的表達(dá)比空白對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均0.001)。在 Derp 10ug/ml 刺激 12h、36h 后,TSLP50ng/ml 刺激 24h和TSLP 20ng/ml刺激36h后,IL-1 β 50ng/ml刺激24h后,TGM2的表達(dá)均比空白對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.01)。在TSLP20ng/ml刺激12h后,Derp1Oug/ml 刺激 24h 和 36h 后,TSLP 50ng/ml 或 IL-1 β 50ng/ml 刺激 24h 后,TGM3的表達(dá)均比空白對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.001)。在derp 10ug/ml刺激 24h、36h,TSLP50ng/ml、IL-1 β 50ng/m L 刺激 24h,TSLP 20ng/ml 刺激 36h 后,TGM5的表達(dá)均比對(duì)照組的表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.001)。④CD209siRNA轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,CD209mRNA表達(dá)開始下降,CD209蛋白表達(dá)在72h時(shí)下降最明顯。ELISA結(jié)果顯示CD209可以與TGM3結(jié)合,激光共聚焦顯微鏡下及流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示TGM3可以被293T及MDDCs細(xì)胞上的CD209識(shí)別并結(jié)合攝取入細(xì)胞內(nèi),其結(jié)合能力可以被CD209阻斷抗體及CD209siRNA部分阻斷。⑤TGM3刺激24h后,MDDCs上的CD83、CD86分子及培養(yǎng)上清中炎癥因子IL-6的表達(dá)水平與空白組、CD209抗體封閉組(a-CD209)比較有顯著差異(CD83:P0.001;CD86:P=0.007;IL-6:P=0.006)。⑥與空白組比較,TGM3—MDDCs-T細(xì)胞混合培養(yǎng)組的IFN-γ的表達(dá)升高,表達(dá)比率和MFI值均升高。與空白組比較,TGM3—MDDCs-T細(xì)胞混合培養(yǎng)組的TNF-α,IFN-γ分泌增加,差異有顯著性(P=0.0018)。研究結(jié)論:①AD患者血清中TGMs sIgE 水平明顯升高,TGMs可能是AD患者的一種內(nèi)源性自身抗原。②AD患者皮損中TGM3的mRNA和蛋白表達(dá)均升高。③在一定的濃度 Derp、TSLP、IL-1 β 刺激下,HaCat 細(xì)胞的 TGM1、TGM2、TGM3、TGM5基因的表達(dá)均有不同程度的升高。④CD209 siRNA可有效降低CD209的mRNA和蛋白的表達(dá)。TGM3被CD209識(shí)別結(jié)合,并被介導(dǎo)攝取進(jìn)入MDDC細(xì)胞內(nèi)。⑤TGM3可刺激活化MDDC和促進(jìn)IL-6表達(dá)升高。⑥TGM3—MDDCs可能誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞亞群分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R758.2

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本文編號(hào)：2366020