【摘要】：研究背景和目的胃癌(Gastric carcinoma,GC)是一種常見的消化道惡性腫瘤,具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)。在全世界范圍內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率的排名中居于第5位,而致死率則位居第3位。在我國惡性腫瘤的發(fā)病率中位居第2位,死亡率位列第3位,因此研究引起胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制,進(jìn)而探索新的干預(yù)措施,提高胃癌的治療效果,達(dá)到延長患者的存活率,改善患者的生活質(zhì)量的目的等方面均具有重大的意義。腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制已被認(rèn)為是腫瘤逃避免疫破壞的關(guān)鍵因素之一,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。T-reg細(xì)胞作為腫瘤免疫逃逸機(jī)制的一種重要媒介,CD4+CD25+Fox3+Treg細(xì)胞則是T-reg細(xì)胞中的一種特殊的亞群,具有免疫抑制和免疫無能兩大特性,并在多種惡性腫瘤的組織和外周血中呈現(xiàn)出高表達(dá),可能在腫瘤的特異性位點(diǎn)抑制腫瘤的T細(xì)胞反應(yīng)。在對腫瘤的免疫抑制機(jī)制進(jìn)行研究的同時(shí),隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,也在針對性的研究了在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用的蛋白編碼基因功能。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)已被證實(shí)參與胃腸道腫瘤的形成與發(fā)展,并可能以多種方式參與基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,可作為早期消化道腫瘤的篩查標(biāo)志。既往對胃癌的lncRNA的研究中,主要是對胃癌組織及癌旁組織的lncRNA進(jìn)行檢測,并且對胃癌發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在腫瘤細(xì)胞的lncRNA的表達(dá)異常上,而很少涉及腫瘤免疫細(xì)胞的作用機(jī)制。本研究擬通過與健康對照組相對比,檢測胃癌患者外周血中T細(xì)胞是否存在異常分布。并通過高通量芯片篩查技術(shù)探索相應(yīng)T細(xì)胞中是否存在lncRNA異常表達(dá),經(jīng)篩查出具有高表達(dá)及高穩(wěn)定性的linc-POU3F3作為代表,探索linc-POU3F3與T-reg細(xì)胞之間的相關(guān)作用。此外,前人研究已發(fā)現(xiàn)T-reg細(xì)胞通過TGF-beta信號通路發(fā)揮作用,并且有研究認(rèn)為linc-POU3F3也可直接激活TGF-beta信號通路而在腫瘤的增殖中起作用,但具體機(jī)制尚不明確。因此,在本研究最后部分?jǐn)M通過免疫共沉淀技術(shù)來揭示linc-POU3F3的調(diào)控作用,并探索其與T-reg細(xì)胞的相互作用機(jī)制。研究方法在本研究中,首先采集胃癌患者(n=40)及健康對照組(n=40)的外周血,通過細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)提取外周血中的T淋巴細(xì)胞,并采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血中T-reg細(xì)胞的表達(dá)。同時(shí),運(yùn)用高通量長鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)錄基因芯片技術(shù)對胃癌患者的血漿樣本進(jìn)行篩選,選擇表達(dá)最高也最穩(wěn)定的lncRNA作為候選的研究目標(biāo),并將其與胃癌患者的相關(guān)臨床信息進(jìn)行結(jié)合分析。經(jīng)RT-PCR對其進(jìn)行檢測,從而了解該lncRNA在胃癌外周血中T-reg細(xì)胞中表達(dá)。在第二部分研究中,主要針對linc-POU3F3在免疫細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中的功能進(jìn)行研究。為了進(jìn)一步探索linc-POU3F3對T細(xì)胞的作用,尤其是對T-reg細(xì)胞分布的影響。采用慢病毒包裝及轉(zhuǎn)染的方法將linc-POU3F3與T細(xì)胞相結(jié)合從而獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株,并通過免疫熒光及RT-PCR檢測linc-POU3F3的表達(dá)狀態(tài),并采用流式細(xì)胞學(xué)檢測經(jīng)慢病毒包裝的T-reg細(xì)胞的表達(dá)水平。應(yīng)用Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)將過表達(dá)linc-POU3F3的T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)增殖,從而觀察腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)。最后部分,針對linc-POU3F3的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。據(jù)研究,linc-POU3F3可以直接激活TGF-beta信號通路,并且T-reg細(xì)胞的分布與TGF-beta信號通路是密切相關(guān)的。在此研究階段,我們采用放射免疫沉淀技術(shù)及western blot方法來檢測linc-POU3F3與TGF-beta之間的作用。研究結(jié)果經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測在胃癌患者外周血中調(diào)節(jié)性T-reg細(xì)胞的分布水平明顯高于健康對照組,而且通過lncRNA微列檢測表明在胃癌患者T-reg細(xì)胞的lncRNAs與對照組相比表達(dá)異常。通過對已知的腫瘤相關(guān)的lncRNA進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)linc-POU3F3表現(xiàn)出最高的倍數(shù)變化以及最穩(wěn)定的表達(dá)形態(tài),因此我們將linc-POU3F3作為潛在的標(biāo)志物進(jìn)行研究。結(jié)合胃癌患者的有關(guān)臨床資料進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)linc-POU3F3可能對患者胃癌的生長分布及臨床TNM分期等方面均有一定的影響作用。在體外細(xì)胞功能的研究發(fā)現(xiàn),通過慢病毒包裝轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞中l(wèi)inc-POU3F3呈現(xiàn)出過表達(dá)狀態(tài),linc-POU3F3的過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的增殖及侵襲能力,并伴有體外T-reg細(xì)胞的分布增加。進(jìn)一步將T-reg細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),結(jié)果表明linc-POU3F3上調(diào)培養(yǎng)的T細(xì)胞明顯促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖。在對linc-POU3F3調(diào)控機(jī)制的研究則顯示與TGF-beta信號通路的激活相關(guān)。通過體外實(shí)驗(yàn)表明,linc-POU3F3可以直接與TGF-beta相結(jié)合,引起TGF-beta的上調(diào),并通過Smad2/3磷酸化激活TGF-beta信號通路,從而在增加胃癌細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要的作用,進(jìn)而進(jìn)一步的影響著胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。結(jié)論linc-POU3F3過表達(dá)可導(dǎo)致胃癌患者外周血中T-reg細(xì)胞的分布增加,并且linc-POU3F3過表達(dá)的T-reg細(xì)胞可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖能力并通過招募TGF-beta從而激活TGF-beta信號通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究可能為胃癌免疫細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的功能的探索提供了新的思路。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2363297