【摘要】：胰腺癌是最為致命的惡性腫瘤之一,其5年生存率不足5%。就目前來(lái)說(shuō),手術(shù)治療是胰腺癌患者治愈的唯一機(jī)會(huì),但是大多數(shù)胰腺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)是局部晚期或者已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,已經(jīng)無(wú)法進(jìn)行手術(shù)。另一些可以進(jìn)行手術(shù)的患者,在術(shù)后也可能會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移。因此,尋找胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記和治療靶點(diǎn)具有重要的意義。HPA1是哺乳動(dòng)物中唯一能夠切割細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸乙酰肝素側(cè)鏈的內(nèi)切性糖苷酶,肝素酶m RNA編碼61.2k Da的肝素酶前體,隨后被剪切形成以非共價(jià)鍵結(jié)合的8k Da和50k Da組成的具有酶活性的異源二聚體。HPA1在多種腫瘤中存在過(guò)表達(dá)的情況,且HPA1過(guò)表達(dá)的患者預(yù)后通常較差。HPA1可以降解細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分解,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外,HPA1可以釋放硫酸乙酰肝素側(cè)鏈所結(jié)合的一些生長(zhǎng)因子和血管生長(zhǎng)因子,促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和血管新生。一旦HPA1的活性被抑制,細(xì)胞中沒(méi)有其他的酶來(lái)代替它行使功能,因此,HPA1是一個(gè)理想的治療腫瘤的靶點(diǎn)。吉西他濱是一種阿糖胞苷類似物,是治療胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)藥物,可以單獨(dú)或者聯(lián)合其他藥物用于胰腺癌的治療。吉西他濱通過(guò)核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),其代謝產(chǎn)物吉西他濱三磷酸鹽可以抑制DNA聚合酶和胞嘧啶核苷三磷酸合成酶的活性,而且可以摻入到DNA中,使得DNA延長(zhǎng)提前終止。盡管吉西他濱可以作用于腫瘤細(xì)胞的多個(gè)靶點(diǎn),但是吉西他濱的治療效果并不是很理想,而且腫瘤細(xì)胞還經(jīng)常對(duì)吉西他濱產(chǎn)生耐藥性。鑒于大多數(shù)胰腺癌患者對(duì)于吉西他濱反應(yīng)不理想,而那些開(kāi)始對(duì)吉西他濱敏感的患者最終可能產(chǎn)生耐藥性,因此,在治療胰腺癌領(lǐng)域急需有更好的藥物能夠取代吉西他濱或者提高吉西他濱的治療效果。NF-κB是一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥反應(yīng)和先天性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,同時(shí)可以被多種刺激所激活,包括一些生長(zhǎng)因子、炎癥因子、化療藥物等。NF-κB是由Rel家族的成員(p65/Rel A、c-Rel、Rel B、NFκB1/p50、NF-κB2/p52)組成的同源或者異源的二聚體,最常見(jiàn)的二聚體是由p65/Rel A和p50組成。NF-κB激活后,IκB磷酸化并釋放Rel二聚體,隨后Rel二聚體進(jìn)入細(xì)胞核并激活相關(guān)目的基因的表達(dá)。在胰腺癌細(xì)胞中存在NF-κB信號(hào)通路持續(xù)激活的情況,這被認(rèn)為和胰腺癌細(xì)胞的耐藥密切相關(guān),而且治療胰腺癌的藥物吉西他濱還可以激活NF-κB信號(hào)通路。此外,NF-κB還可以調(diào)控多個(gè)和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。因此,NF-κB可以作為一個(gè)良好的治療靶點(diǎn)聯(lián)合其他的化療藥物一起使用。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),HPA1在正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞中表達(dá)要低于胰腺癌組織,HPA1可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。但是,HPA1在胰腺癌臨床中的診斷意義以及HPA1促進(jìn)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。我們利用免疫組化在43例胰腺癌標(biāo)本中檢測(cè)了HPA1的表達(dá),并分析了HPA1與胰腺癌患者的預(yù)后以及病理特征之間的關(guān)系。我們還發(fā)現(xiàn)了吉西他濱可以促進(jìn)HPA1的表達(dá),隨后通過(guò)q RT-PCR,Western Blot,免疫熒光,染色質(zhì)免疫共沉淀等方法研究了吉西他濱促進(jìn)HPA1表達(dá)的分子機(jī)制,明確了NF-κB信號(hào)通路在HPA1表達(dá)調(diào)控中所發(fā)揮的作用。通過(guò)Transewell侵襲實(shí)驗(yàn)研究了HPA1在吉西他濱促進(jìn)的胰腺癌細(xì)胞侵襲中所發(fā)揮的作用。主要的結(jié)論和結(jié)果:1.HPA1在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常的胰腺導(dǎo)管細(xì)胞,HPA1主要定位于細(xì)胞漿中,且HPA1高表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后更差,其腫瘤的分化程度越低。62.8%(27/43)的胰腺癌患者的標(biāo)本中HPA1呈高表達(dá),HPA1與胰腺癌患者的腫瘤分化相關(guān),但是與性別、腫瘤大小、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)顯著相關(guān)。HPA1在正常的胰腺導(dǎo)管中低表達(dá),通過(guò)Kaplan-Meier生存分析表明HPA1高表達(dá)患者總體生存時(shí)間更短。2.HPA1的表達(dá)與p65呈正相關(guān)通過(guò)免疫組化染色,我們發(fā)現(xiàn)NF-κB的亞基p65的表達(dá)與HPA1的表達(dá)呈正相關(guān)(p=0.006),提示NF-κB信號(hào)通路可能參與HPA1的表達(dá)調(diào)控。3.HPA1主要定位于細(xì)胞漿中,且HPA1可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲通過(guò)免疫熒光染色技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)HPA1主要定位在胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞漿中。通過(guò)CRISP/Cas9技術(shù),我們構(gòu)建了HPA1過(guò)表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞系。在體外實(shí)驗(yàn)中,HPA1過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖,而使用si RNA敲低HPA1表達(dá)可以抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲;在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,HPA1過(guò)表達(dá)組形成的移植瘤要大于對(duì)照組,免疫組化染色也證實(shí)過(guò)表達(dá)HPA1組Ki-67陽(yáng)性率更高。同時(shí),過(guò)表達(dá)HPA1可以抑制上皮表型標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá),促進(jìn)間質(zhì)型標(biāo)記物Vimentin、Zeb-1、Snail的表達(dá)。4.HPA1可以通過(guò)促進(jìn)EGFR的磷酸化,激活下游信號(hào)通路Western blot結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)HPA1可以促進(jìn)EGFR的磷酸化,隨后促進(jìn)src的磷酸化,激活下游的信號(hào)通路。5.吉西他濱通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞HPA1的表達(dá)q RT-PCR結(jié)果顯示,吉西他濱促進(jìn)HPA1的表達(dá)呈時(shí)間和劑量的依賴性。在裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)中,腹腔注射吉西他濱后將移植瘤以q RT-PCR和免疫組化檢測(cè)HPA1的表達(dá),同樣顯示吉西他濱可以在體內(nèi)促進(jìn)HPA1的表達(dá)。為了研究吉西他濱促進(jìn)HPA1的分子機(jī)制,我們使用了一系列信號(hào)通路抑制劑來(lái)預(yù)處理細(xì)胞,隨后以吉西他濱處理。q RT-PCR和western blot結(jié)果表明,NF-κB的抑制劑可以抑制吉西他濱促進(jìn)的HPA1表達(dá)。同時(shí),吉西他濱能夠促進(jìn)p65轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核,而染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示p65可以結(jié)合到HPA1的啟動(dòng)子區(qū)域。6.HPA1抑制劑能夠抑制吉西他濱促進(jìn)的胰腺癌細(xì)胞侵襲吉西他濱處理可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲,而加入HPA1的抑制劑可以抑制吉西他濱促進(jìn)的胰腺癌細(xì)胞的侵襲,同樣加入NF-κB的抑制劑也可以抑制吉西他濱促進(jìn)的胰腺癌細(xì)胞的侵襲。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.9

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本文編號(hào)：2309255