【摘要】：自上世紀(jì)90年代以來(lái),人口出生率的下降和人均預(yù)期壽命的延長(zhǎng)使中國(guó)人口老齡化的現(xiàn)象日益突出。隨著年齡的增長(zhǎng),正常老年人客觀上都發(fā)生腦老化,并伴隨有不同程度的記憶力減退。此外,阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)等神經(jīng)退行性疾病引發(fā)的認(rèn)知功能障礙也成為困擾老年人的一大難題。因此,研究認(rèn)知衰老的相關(guān)機(jī)制,探尋延緩腦老化、改善學(xué)習(xí)和記憶障礙的有效干預(yù)措施,對(duì)實(shí)現(xiàn)健康老齡化和提高老年人生活質(zhì)量至關(guān)重要。火麻仁提取液(Extraciton of Fructus Cannabis,EFC)的來(lái)源是火麻仁的干燥成熟果實(shí),其主要成分是飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)火麻仁對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等具有廣泛的藥理作用,在抗氧化、抗炎、抗血栓和降低血脂等方面也有良好的療效。但火麻仁是否對(duì)與老齡相關(guān)的認(rèn)知損害有預(yù)防保護(hù)作用尚不清楚。目的:用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)建立亞急性衰老大鼠模型,觀察EFC對(duì)D-gal致衰老大鼠在Morris水迷宮(Morris water maze,MWM)空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響,并在m RNA和蛋白水平檢測(cè)與腦老化相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)情況,探討衰老過(guò)程中認(rèn)知減退的分子生物學(xué)機(jī)制;同時(shí)進(jìn)一步在細(xì)胞水平,通過(guò)D-gal誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH/3T3)的老化,觀察EFC干預(yù)對(duì)細(xì)胞衰老進(jìn)程的影響。綜上所述,本研究旨在探討EFC對(duì)D-gal致衰老大鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶障礙的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:1.將雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組,每組8只,分組方法如下:正常對(duì)照組(control)、D-gal模型組(400mg/kg)、EFC(200mg/kg)預(yù)防組、EFC(400mg/kg)預(yù)防組、D-gal+EFC(200mg/kg)組及D-gal+EFC(400mg/kg)組。以D-gal(400mg/kg)連續(xù)腹腔注射14周的方法建立亞急性衰老模型。D-gal模型組大鼠每日給予腹腔注射D-gal 400mg/kg,每日一次,連續(xù)給藥14周;正常對(duì)照組給予腹腔注射等量生理鹽水。EFC預(yù)防組于D-gal造模前分別預(yù)防性給予200mg/kg、400 mg/kg EFC連續(xù)灌胃14周,隨后給予D-gal腹腔注射14周。D-gal+EFC組為D-gal造模同時(shí)分別給予EFC 200mg/kg、400mg/kg灌胃,連續(xù)14周。此外,正常對(duì)照組與D-gal模型組給予等量生理鹽水的灌胃。2.利用Morris水迷宮評(píng)估D-gal致衰老大鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力。3.采用HE染色法觀察D-gal致衰老大鼠海馬錐體神經(jīng)元的病理結(jié)構(gòu)變化。4.WST-1法測(cè)定大鼠腦組織中的總超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD)活力及TBA法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平。5.稱重并計(jì)算心臟、肝臟、脾臟和胸腺的臟器系數(shù)。6.應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬齒狀回γ-H2AX及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP的表達(dá)。7.應(yīng)用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)并比較各組大鼠海馬組織中的APP、Tau、PS1基因的m RNA的表達(dá)差異。8.免疫印跡法檢測(cè)大鼠海馬組織中與腦老化相關(guān)的total Tau,p-Tau、PS1蛋白的表達(dá)水平。9.以D-gal誘導(dǎo)NIH/3T3細(xì)胞的老化,EFC作為干預(yù)因素,從以下幾方面探討EFC對(duì)D-gal致衰老細(xì)胞的作用:9.1加載DHE熒光探針初步評(píng)估細(xì)胞內(nèi)總ROS生成量后,應(yīng)用FACS流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞內(nèi)總ROS水平。9.2檢測(cè)各處理組細(xì)胞的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(Senescence-associated-β-galactose,SA-β-gal)的活性。9.3免疫熒光法測(cè)定各處理組細(xì)胞的DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX及p-ATM的表達(dá)。9.4免疫印跡法檢測(cè)各處理組細(xì)胞的SIRT1、p53、p21蛋白表達(dá)水平。所得結(jié)果分述如下:第一部分EFC對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠氧化損傷的保護(hù)作用結(jié)果:1.D-gal模型組與對(duì)照組相比,腦組織SOD活性降低,MDA水平升高(P0.05);EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg/kg)組與D-gal模型組相比,腦組織SOD活性明顯升高而MDA水平顯著下降(P0.05)。2.D-gal模型組大鼠的心臟、肝臟、脾及胸腺系數(shù)明顯降低,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);而EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg/kg)大鼠與D-gal模型組相比,上述各臟器系數(shù)明顯升高(P0.05)。3.大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元HE染色結(jié)果顯示,D-gal模型組與正常對(duì)照組相比,海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)松散、排列稀疏,大部分細(xì)胞胞核出現(xiàn)核固縮,染色加深;D-gal+EFC(400mg/kg)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元較D-gal模型組排列緊密,出現(xiàn)核固縮的細(xì)胞數(shù)量明顯減少;EFC(400mg/kg)預(yù)防組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元形態(tài)基本正常,但錐體細(xì)胞層數(shù)較正常對(duì)照組少且細(xì)胞排列稍顯疏松。結(jié)論:1.EFC可通過(guò)提高大鼠抗氧化能力,有效改善D-gal引發(fā)的衰老相關(guān)癥狀。2.EFC可通過(guò)提高脾和胸腺系數(shù)增強(qiáng)大鼠的免疫功能,從而延緩大鼠衰老。3.EFC能減輕D-gal對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元造成的損傷。第二部分EFC對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用結(jié)果:1.空間定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組大鼠在第1天測(cè)試中的搜臺(tái)潛伏期和到達(dá)平臺(tái)的距離無(wú)顯著差異。但第2天到第5天測(cè)試結(jié)果顯示,D-gal組大鼠的搜臺(tái)潛伏期和到達(dá)平臺(tái)距離與對(duì)照組相比,明顯延長(zhǎng)(P0.05)。EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg/kg)組大鼠的搜臺(tái)潛伏期和到達(dá)平臺(tái)距離與D-gal組相比,顯著縮短(P0.05)。2.定向航行訓(xùn)練第5天,各組大鼠的游泳軌跡顯示,D-gal模型組的游泳軌跡雜亂無(wú)序,運(yùn)動(dòng)軌跡隨機(jī)分布于各個(gè)象限;而EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg/kg)組的游泳軌跡接近正常對(duì)照組,搜索平臺(tái)的策略明顯改善,其運(yùn)動(dòng)軌跡多位于原平臺(tái)位置所在象限或相鄰的象限。3.空間探索測(cè)試中,D-gal模型組大鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯減少,在原平臺(tái)象限停留的時(shí)間也顯著縮短(P0.05)。而EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg/kg)組大鼠與D-gal模型組相比,穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯增加,在原平臺(tái)象限停留的時(shí)間延長(zhǎng)(P0.05)。4.D-gal模型組大鼠海馬齒狀回GFAP和γ-H2AX陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量,與正常對(duì)照組相比明顯增多(P0.05),而EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg/kg)組大鼠GFAP和γ-H2AX陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量與D-gal模型組相比則明顯減少(P0.05)。結(jié)論:1.EFC可提高大鼠在Morris水迷宮測(cè)試中的各項(xiàng)成績(jī),對(duì)D-gal引起的空間學(xué)習(xí)及記憶損傷有一定的改善作用。2.EFC可通過(guò)抑制大鼠海馬齒狀回星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,減少GFAP的陽(yáng)性表達(dá)來(lái)達(dá)到保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用,從而提高大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。3.EFC可通過(guò)減輕大鼠海馬齒狀回細(xì)胞的DNA損傷,使γ-H2AX焦點(diǎn)的數(shù)量減少,進(jìn)而改善大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。第三部分EFC對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠APP、Tau及PS1基因的影響結(jié)果:q RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,D-gal組海馬組織的APP、Tau、PS1 m RNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P0.05);與D-gal組相比,EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg/kg)組大鼠海馬組織中的APP、Tau、PS1 m RNA的相對(duì)表達(dá)量則顯著下降(P0.05)。結(jié)論:EFC可下調(diào)大鼠海馬組織APP、Tau、PS1基因m RNA的表達(dá),進(jìn)而延緩D-gal致衰老大鼠的神經(jīng)退行性病變,改善認(rèn)知功能。第四部分EFC對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠Tau,PS1蛋白表達(dá)的影響結(jié)果:免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,D-gal模型組海馬組織Tau蛋白S396位點(diǎn)的磷酸化程度及PS1蛋白的表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯升高(P0.05),而EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg/kg)組與D-gal模型組相比,海馬組織Tau蛋白S396位點(diǎn)的磷酸化程度與PS1蛋白表達(dá)水平明顯下降(P0.05)。但各組間總Tau蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。結(jié)論:EFC可能通過(guò)下調(diào)Tau蛋白磷酸化程度及PS1蛋白的表達(dá)水平,以此發(fā)揮延緩腦老化的作用,改善D-gal所致的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙。第五部分EFC對(duì)SIRT1表達(dá)及p53-p21途徑的影響及其機(jī)制結(jié)果:1.ROS熒光探針(DHE)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,D-gal(400m M)處理組細(xì)胞產(chǎn)生的ROS熒光信號(hào)顯著增強(qiáng),EFC(50μg/ml)預(yù)處理24h后,ROS熒光信號(hào)明顯減弱。FACS流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)結(jié)果表明,D-gal處理組細(xì)胞ROS生成百分比最高達(dá)45.2%,對(duì)照組為1.4%,D-gal+EFC組及EFC組分別為3.2%和2.5%。2.D-gal處理組的衰老細(xì)胞明顯增多,40%的3T3細(xì)胞SA-β-gal染色陽(yáng)性;而D-gal+EFC組及EFC組與D-gal處理組相比,SA-β-gal染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。3.免疫熒光染色結(jié)果顯示,D-gal(400m M)處理后細(xì)胞的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量增加、p-ATM顯色加強(qiáng),而用EFC(50μg/ml)預(yù)處理細(xì)胞24h后,D-gal+EFC組及EFC預(yù)防組γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量減少、p-ATM顯色明顯減弱。4.免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,D-gal處理組NIH/3T3細(xì)胞的SIRT1表達(dá)水平降低,p53、p21表達(dá)水平明顯升高(P0.05),而EFC預(yù)處理細(xì)胞24h后,D-gal+EFC組及EFC組的SIRT1表達(dá)上調(diào),p53、p21表達(dá)顯著下降(P0.05)。結(jié)論:1.EFC可能通過(guò)提高NIH/3T3細(xì)胞的抗氧化能力而抑制ROS的生成,進(jìn)而延緩細(xì)胞老化,使SA-β-gal表達(dá)下調(diào);提高DNA損傷修復(fù)能力從而減輕D-gal誘發(fā)的細(xì)胞DNA損傷,使DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX及p-ATM表達(dá)降低。2.EFC可能通過(guò)上調(diào)NIH/3T3細(xì)胞的SIRT1表達(dá)水平而降低衰老相關(guān)蛋白p53、p21的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮延緩細(xì)胞衰老的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2306455