【摘要】：研究背景及意義胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在發(fā)展中國(guó)家,尤其是東亞、東歐和南美,每年有超過(guò)70%的新發(fā)病例和死亡病例。在中國(guó),胃癌已成為惡性腫瘤中發(fā)病率第二位的腫瘤。盡管一些胃癌患者的惡性腫瘤能夠完整切除,他們?nèi)匀活A(yù)后不良,5年生存率只有20-30%。多數(shù)胃癌患者在確診時(shí),腫瘤已經(jīng)發(fā)展到了進(jìn)展期,而喪失了手術(shù)機(jī)會(huì),這些患者的中位生存時(shí)間通常不到一年。雖然多種新型抗腫瘤藥物和改良的手術(shù)方式不斷涌現(xiàn),胃癌尤其是晚期胃癌,仍然是一個(gè)無(wú)法克服的難題。胃癌患者高死亡率主要是由于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,而這個(gè)過(guò)程是一個(gè)與多因素誘發(fā)、多基因改變、多步驟參與的病理生理過(guò)程。因此,研究胃癌發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制,控制胃癌的發(fā)生發(fā)展刻不容緩。RLIP76是一個(gè)76-kDa的剪接變異體,由人類(lèi)基因RalBP1(18p11.22)編碼。它是一個(gè)Ral結(jié)合蛋白,也被稱(chēng)為RalBP1。最初,RLIP76被認(rèn)為是一個(gè)RalGTP酶效應(yīng)蛋白,銜接Ral和Rho通路。它參與ATP的水解,將多種物質(zhì),如谷胱甘肽結(jié)合物(GS-E)和化療藥物運(yùn)輸出細(xì)胞。RLIP76是Ras家族的成員之一,Ras有多種下游信號(hào)蛋白分子,如VEGF,而且Ras的活化在人類(lèi)惡性腫瘤的病理生理過(guò)程中起著不可或缺的作用。在細(xì)胞的生命過(guò)程中,Akt信號(hào)通路是一個(gè)基本的信號(hào)傳遞軸,在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存及凋亡方面發(fā)揮著重要作用,而Akt也是Ras信號(hào)通路的下游分子。早期針對(duì)RLIP76的研究主要集中于其對(duì)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)它在一系列的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。它參與形成多功能蛋白復(fù)合體,例如有絲分裂紡錘體和EGF、TGF-β等受體信號(hào)復(fù)合物,調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂、增殖、分化、凋亡和內(nèi)吞過(guò)程,并且在受體-配體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起決定性的作用。研究表明,RLIP76在人體多種組織中均有表達(dá),如肝臟、心臟、卵巢、肺臟、肌肉和腎臟。而在很多惡性腫瘤中,其表達(dá)明顯升高,且與腫瘤的放化療敏感性有密切關(guān)系。在結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR中,敲除RLIP76能夠增加細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性,使長(zhǎng)春新堿的IC50降低。在乳腺腫瘤中,RLIP76的表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān),與患者生存率呈負(fù)相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,用抗體和RNAi阻斷RLIP76,能夠改善惡性腫瘤對(duì)化療和放療的敏感性,并能縮小非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和B16黑色素瘤等實(shí)體瘤的體積。同時(shí),體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),敲除或阻斷RLIP76可誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞和粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞等多種組織來(lái)源的細(xì)胞發(fā)生凋亡。這些數(shù)據(jù)提示我們,將RLIP76作為治療靶點(diǎn)是抗腫瘤治療的一個(gè)新方向。基于以往研究,我們推測(cè)RLIP76在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著舉足輕重的作用。因此,本研究首先觀察了 RLIP76在胃癌組織中的表達(dá)水平,然后通過(guò)慢病毒干擾實(shí)驗(yàn)探討了其對(duì)胃癌細(xì)胞功能的影響及機(jī)制。研究結(jié)果表明,與胃部良性腫瘤胃粘膜相比,胃癌組織中RLIP76的表達(dá)明顯升高;與相應(yīng)的癌旁組織相比,RLIP76在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯升高,并與患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染敲除胃癌細(xì)胞系SGC7901和MGC803中的RLIP76后,發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的增殖顯著減慢,細(xì)胞凋亡顯著增加,血管形成顯著減少。最后,我們檢測(cè)了 RLIP76敲除后Akt/mTOR信號(hào)通路的變化,發(fā)現(xiàn)Akt和mTOR的磷酸化水平明顯降低。本研究結(jié)果證實(shí),RLIP76通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/mTOR信號(hào)通路的磷酸化水平調(diào)節(jié)胃癌的惡性轉(zhuǎn)化,該結(jié)果為其作為胃癌的治療靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ),開(kāi)辟了新思路,具有潛在的實(shí)際臨床應(yīng)用價(jià)值。第一部分RLIP76在胃癌中的表達(dá)及臨床意義目的:1.觀察RLIP76在正常胃粘膜,胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況2.分析RLIP76在胃癌中的表達(dá)變化與多種臨床指標(biāo)的相關(guān)性方法:1.選取2013年1月到2014年1月期間,于山東省立醫(yī)院手術(shù)治療的76例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本,中位年齡46歲,同時(shí)選取40例胃部良性腫瘤患者的胃粘膜標(biāo)本作為陰性對(duì)照。另外收集2009年2月到2010年7月期間于山東省立醫(yī)院手術(shù)治療的114例胃癌患者的癌組織及癌旁組織標(biāo)本,其中男性69例,女性45例,并收集患者的臨床資料。2.將收集的所有手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色,并進(jìn)行評(píng)分,研究RLIP76不同表達(dá)水平,聯(lián)合患者的臨床資料,用SPSS17.0建立數(shù)據(jù)庫(kù),Kaplan-Meier法進(jìn)行生存因素分析,繪制生存函數(shù)曲線。用卡方檢驗(yàn)評(píng)估RLIP76與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等各臨床指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果:1.76例胃癌組織標(biāo)本和40例胃部良性腫瘤患者胃粘膜標(biāo)本染色中,胃癌組織中的RLIP76的表達(dá)水平明顯高于胃粘膜表達(dá)水平。2.114例胃癌組織RLIP76的免疫組化染色中,有53例RLIP76陽(yáng)性表達(dá),61例呈中-低(陰性)表達(dá)�？ǚ綑z驗(yàn)顯示,RLIP76的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān),與性別、年齡、腫瘤大小和腫瘤分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。生存曲線顯示RLIP76的表達(dá)水平與患者預(yù)后(p0.05)有明顯相關(guān)性。結(jié)論:RLIP76與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和腫瘤預(yù)后相關(guān),提示RLIP76在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。第二部分靶向敲除RLIP76,觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目的:建立RLIP76低表達(dá)細(xì)胞模型并研究RLIP76對(duì)胃癌腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物學(xué)功能的影響及機(jī)制。方法:1.體外培養(yǎng)DH5α感受態(tài)細(xì)胞,胃腺癌細(xì)胞系SGC7901和MGC803細(xì)胞;2.病毒設(shè)計(jì):Genebank基因序列檢索查詢(xún)RLIP76的基因序列,根據(jù)基因序列分別設(shè)計(jì)并合成寡聚單鏈DNA及一個(gè)Scramble序列,將寡聚單鏈DNA退火成雙鏈,將雙鏈的ShRNA oligo分別插入到ShRNA慢病毒載體中,構(gòu)建ShRNA慢病毒重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α。經(jīng)病毒包裝及病毒滴度測(cè)定后,構(gòu)建pGMLV-SC5慢病毒介導(dǎo)的ShRNARLIP76,并加綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性雙重標(biāo)記。3.病毒轉(zhuǎn)染:根據(jù)說(shuō)明書(shū)提供的MOI(multiplicity of infection)值,將pGMLV-SC5慢病毒介導(dǎo)的ShRNA RLIP76和Scramble載體轉(zhuǎn)染入胃癌腫瘤細(xì)胞系SGC7901和MGC803。用慢病毒介導(dǎo)的ShRNA載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC7901和MGC803,并在熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光細(xì)胞的比例和熒光強(qiáng)度。經(jīng)過(guò)連續(xù)培養(yǎng)和嘌呤霉素篩選,獲得轉(zhuǎn)染成功的SGC7901和MGC803胃癌細(xì)胞系。4.病毒轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證:通過(guò)qRT-PCR和western blot從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo)的ShRNA RLIP76的敲除效率,篩選敲除效率最好的ShRNA序列。5.細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn):通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)研究慢病毒介導(dǎo)的ShRNA RLIP76和Scramble轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞系SGC7901和MGC803的集落形成能力;通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)慢病毒介導(dǎo)的ShRNA RLIP76和Scramble轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞系SGC7901和MGC803的增殖能力,并繪制增殖曲線;通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)慢病毒介導(dǎo)的ShRNA RLIP76和Scramble轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞系SGC7901和MGC803遷移和侵襲能力改變;通過(guò)明膠酶譜驗(yàn)證細(xì)胞的遷移能力改變。通過(guò)Hoechst 33342染色實(shí)驗(yàn)研究慢病毒介導(dǎo)的ShRNA RLIP76和Scramble轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞系SGC7901和MGC803凋亡水平的變化;通過(guò)Western blot研究RLIP76敲除后,相關(guān)的信號(hào)通路的變化,找到與RLIP76相關(guān)的信號(hào)通路分子。6.統(tǒng)計(jì)分析:通過(guò)GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)值變量?jī)蓚�(gè)獨(dú)立組分析用t檢驗(yàn)。p0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.篩選3個(gè)最優(yōu)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的SiRNA序列,制備pGMLV-SC5慢病毒介導(dǎo)的ShRNA RLIP76載體:ShRNAl,ShRNA2和ShRNA3,并將慢病毒介導(dǎo)的Scramble序列作為陰性對(duì)照。熒光顯微鏡下觀察綠色熒光后,pGMLV-SC5慢病毒介導(dǎo)的ShRNA載體的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%以上,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。2.qRT-PCR 結(jié)果顯示 Sh-scramble、ShRNA1、ShRNA2 和 ShRNA3 轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞系中RLIP76 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為:0.947±0.038、0.246±0.021、0.706±0.109、0.361 ±0.093;轉(zhuǎn)染空病毒、ShRNA1、ShRNA2和ShRNA3后,MGC803細(xì)胞系中RLIP76相對(duì)表達(dá)量分別為:0.973±0.061、0.225±0.009、0.469±0.050、0.377±0.061;ShRNA1 轉(zhuǎn)染后 RLIP76 的敲除效率最高,相對(duì)于空病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。3.Western blot 結(jié)果顯示:SGC7901 轉(zhuǎn)染 Sh-scramble、ShRNA1、ShRNA2和 ShRNA3 后 RLIP76 的相對(duì)表達(dá)量為:1.016±0.181、0.245±0.103、0.709±0.191、0.416±0.107。MGC803 轉(zhuǎn)染 Sh-scramble、ShRNA1、ShRNA2和ShRNA3后RLIP76的相對(duì)表達(dá)量為:0.953±0.143、0.199±0.113、0.565±0.198、0.384±0.205。ShRNA1 轉(zhuǎn)染后,SGC7901 和 MGC803 細(xì)胞中RLIP76蛋白表達(dá)量最少,相對(duì)于轉(zhuǎn)染Scramble序列后RLIP76的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。4.克隆形成結(jié)果示轉(zhuǎn)染ShRNA1后胃癌細(xì)胞系(KD)SGC7901和MGC803的克隆數(shù)少于轉(zhuǎn)染Scrambled ShRNA的胃癌細(xì)胞系(NC)。CCK8結(jié)果示轉(zhuǎn)染ShRNA1后胃癌細(xì)胞系(KD)SGC7901和MGC803的增殖速度慢于轉(zhuǎn)染Scrambled ShRNA的胃癌細(xì)胞系(NC)(p0.05)。說(shuō)明RLIP76敲除后對(duì)細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用。5.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染ShRNA1后胃癌細(xì)胞系(KD)SGC7901的細(xì)胞遷移數(shù)為219.7±43.6,少于轉(zhuǎn)染Scrambled ShRNA的SGC7901胃癌細(xì)胞系(NC):486.7± 128.8(p0.05)。轉(zhuǎn)染 ShRNA1 后胃癌細(xì)胞系(KD)MGC803 的細(xì)胞遷移數(shù)為 333.7±46.5,少于轉(zhuǎn)染 Scrambled ShRNA 的 MGC803胃癌細(xì)胞系(NC):630±95(p0.05)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染ShRNA1后胃癌細(xì)胞系SGC7901的細(xì)胞(KD)穿膜數(shù)為97.7±24.3,少于轉(zhuǎn)染Scrambled ShRNA的SGC7901胃癌細(xì)胞系(NC):306±33.5(p0.05)。轉(zhuǎn)染 ShRNA1 后胃癌細(xì)胞系(KD)MGC803的細(xì)胞穿膜數(shù)為163.3±87.5,少于轉(zhuǎn)染Scrambled ShRNA的MGC803胃癌細(xì)胞系(NC):350±50.9(p0.05)。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RLIP76敲除的細(xì)胞(KD)上清中MMP2降低。6.Hoechst 33342實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染ShRNA1后胃癌細(xì)胞系(KD)SGC7901和MGC803的細(xì)胞凋亡數(shù)量多于轉(zhuǎn)染Scrambled ShRNA的胃癌細(xì)胞系(NC)(p0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染ShRNA1后胃癌細(xì)胞系(KD)SGC7901 和 MGC803 中,凋亡蛋白 Bax、cleaved-PARP、cleaved-caspase-8 和cleaved-caspase-9表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染 scrambled ShRNA的胃癌細(xì)胞系(NC)。且Akt/mTOR信號(hào)通路在病毒轉(zhuǎn)染后也發(fā)生了明顯變化,轉(zhuǎn)染ShRNA1后胃癌細(xì)胞系(KD)SGC7901和MGC803中,p-Akt和p-mTOR的表達(dá)量低于轉(zhuǎn)染scrambled ShRNA 的胃癌細(xì)胞系(NC)(p0.05),而 t-Akt 和 t-mTOR 的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。結(jié)論:1.靶向敲除RLIP76能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移。2.RLIP76敲除后,細(xì)胞凋亡增多,且與Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。第三部分RLIP76對(duì)VEGF分泌及體外血管形成的影響目的:研究RLIP76表達(dá)水平對(duì)VEGF分泌的影響,并明確RLIP76對(duì)血管生成的影響。方法:1.體外培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞。2.在12孔板中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染ShRNA1和Scrambled ShRNA后胃癌細(xì)胞系SGC7901和MGC803,24小時(shí)后收集細(xì)胞上清。3.通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡(jiǎn)稱(chēng) ELISA)VEGF試劑盒檢測(cè)收集的病毒轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞系上清中的VEGF的含量。4.體外小管形成實(shí)驗(yàn):在96孔板中加入預(yù)冷的Matrigel基質(zhì)膠,并在37℃孵育1小時(shí),將培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞與收集的轉(zhuǎn)染病毒后的胃癌細(xì)胞系上清混合,將細(xì)胞混懸液加入鋪有Matrigel基質(zhì)膠的96孔板中并放在孵箱中孵育,2個(gè)小時(shí)后每隔半小時(shí)于顯微鏡下觀察小管形成狀況,并在8h時(shí)進(jìn)行拍照。5.Western blot:通過(guò)免疫蛋白電泳驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)VEGF的變化。結(jié)果:1.ELISA實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染ShRNA1的胃癌細(xì)胞系(KD)SGC7901和MGC803培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞上清中VEGF的濃度分別為(pg/ml):158.582±6.931、264.024±11.177,轉(zhuǎn)染 Scrambled ShRNA 的胃癌細(xì)胞系(NC)SGC7901和MGC803細(xì)胞上清中VEGF的濃度分別為465.048±2.121、463.453±13.350。轉(zhuǎn)染 ShRNA1 的胃癌細(xì)胞系(KD)SGC7901 和 MGC803 培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞上清中VEGF的含量明顯低于轉(zhuǎn)染Scrambled ShRNA后胃癌細(xì)胞系(NC)上清中VEGF的含量(p0.05)。2.小管形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染ShRNA1的胃癌細(xì)胞系(KD)SGC7901和MGC803培養(yǎng)24小時(shí)后收取的上清培養(yǎng)的HUVEC體外管型形成分別為:44.5±3.69、71.8±8.83(%control)(p0.05)。轉(zhuǎn)染 Scrambled ShRNA 的胃癌細(xì)胞系(NC)SGC7901和MGC803培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞上清培養(yǎng)的HUVEC體外管型形成分別為 202.8±83.3、193±3.5(%control)(p0.05)。3.Western blot發(fā)現(xiàn),RLIP76敲除后,VEGF表達(dá)水平降低。SGC7901細(xì)胞中,NC細(xì)胞中VEGF的相對(duì)表達(dá)量為:1.351 ±0.107,KD細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為:0.553±0.071(p0.05)。MGC803細(xì)胞中,NC細(xì)胞中VEGF的相對(duì)表達(dá)量為:1.230±0.230,KD細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為:0.823±0.191(p0.05)。結(jié)論:RLIP76敲除后能夠降低胃癌細(xì)胞VEGF的含量及分泌,并減少血管生成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2306317