【摘要】：第一部分化瘀解毒中藥對梗阻性腎病大鼠腎臟炎性細(xì)胞浸潤和炎性因子表達(dá)的影響目的:觀察梗阻性腎病模型大鼠一般情況、腎臟病理改變、梗阻側(cè)腎臟炎性細(xì)胞浸潤等,同時觀察血液及梗阻側(cè)腎臟白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素18(IL-18)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)等炎性因子變化,探索化瘀解毒中藥對梗阻性腎病大鼠腎臟炎性細(xì)胞浸潤及炎性因子表達(dá)的影響,為化瘀解毒中藥拮抗炎性損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1動物分組和模型制備:40只SD雄性大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、模型(UUO)組、依普利酮(EPL)組及中藥(TCM)組,每組10只。采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)復(fù)制梗阻性腎病大鼠模型。假手術(shù)組僅游離而不結(jié)扎輸尿管。2藥物干預(yù):術(shù)后經(jīng)口給藥,EPL組大鼠給予依普利酮100mg/(kg·d);TCM組給予化瘀解毒中藥煎劑13.7g/(kg·d);Sham組及UUO組給予等容量生理鹽水。每天1次,連續(xù)10天。干預(yù)結(jié)束后斷頭取血,摘取左側(cè)腎臟,部分組織多聚甲醛固定,其余組織-70℃保存。3檢測指標(biāo)與方法:觀察大鼠一般狀況;記錄飲水量及進(jìn)食量;測量24h尿量;稱取體質(zhì)量、梗阻側(cè)腎質(zhì)量,并計(jì)算腎臟指數(shù)(KI);全自動生化分析儀檢測血清肌酐(SCr)、尿肌酐(UCr)、血清尿素(SUr),并計(jì)算肌酐清除率(Ccr);HE染色觀察腎組織炎性細(xì)胞浸潤;SABC法檢測腎臟巨噬細(xì)胞F4/80的表達(dá);放射免疫法檢測血清IL-1β、IL-18、TNF-α含量;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清MCP-1含量;Real time-PCR檢測腎臟IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá);SABC法和Western blot檢測IL-1β蛋白表達(dá)。4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用(x±S)表示,多組比較采用單因素方差分析,組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1各組大鼠一般情況、體質(zhì)量、腎質(zhì)量及KI比較:Sham組進(jìn)食量、飲水量穩(wěn)定,體質(zhì)量增長穩(wěn)定,反應(yīng)敏捷。各造模組大鼠進(jìn)食量、飲水量均有所下降,體質(zhì)量增長緩慢,反應(yīng)能力減弱。UUO術(shù)后10天,與Sham組相比,UUO組大鼠體質(zhì)量下降(P0.05)、梗阻側(cè)腎臟增大,腎質(zhì)量明顯增加(P0.01)、梗阻側(cè)KI亦明顯上升(P0.01);與UUO組相比,EPL組及TCM組大鼠的梗阻側(cè)腎質(zhì)量明顯下降(P0.05)、體質(zhì)量有所增加、梗阻側(cè)KI亦有下降趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2各組大鼠腎功能比較:與Sham組相比,UUO組SCr、SUr未見明顯升高,Ccr未見明顯降低(P0.05);與UUO組相比,EPL組及TCM組各指標(biāo)未見明顯變化(P0.05)。3各組大鼠腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤情況比較:HE染色顯示,Sham組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)基本正常,腎間質(zhì)偶見炎性細(xì)胞浸潤;UUO組大鼠輸尿管擴(kuò)張,腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤明顯增多,腎小管上皮細(xì)胞變性、濁腫甚至壞死;EPL組及TCM組大鼠輸尿管擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞亦有變性與濁腫,但炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。4各組大鼠腎組織F4/80表達(dá)比較:Sham組大鼠腎間質(zhì)僅見少量F4/80陽性細(xì)胞;UUO組F4/80陽性細(xì)胞浸潤明顯增多,主要表達(dá)于髓質(zhì);EPL及中藥組可見到陽性細(xì)胞,但較UUO組明顯減少。5各組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α及MCP-1含量比較:與Sham組大鼠比較,UUO組血清IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1含量明顯升高(P0.01);與UUO組大鼠比較,EPL組血清IL-1β、TNF-α、MCP-1含量明顯降低(P0.01)、IL-18亦有下降趨勢(P0.05);與UUO組大鼠比較,TCM組血清IL-1β、TNF-α含量明顯降低(P0.01),MCP-1含量降低(P0.05),IL-18含量亦有下降趨勢(P0.05)。6各組大鼠腎臟IL-1β、TNF-α、MCP-1 m RNA表達(dá)比較:與Sham組大鼠比較,UUO組腎組織IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá)明顯升高(P0.01);與UUO組大鼠比較,EPL組和TCM組腎組織IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá)明顯降低(P0.01)。7 SABC法檢測各組大鼠腎臟IL-1β蛋白表達(dá)比較:Sham組腎組織IL-1β呈弱表達(dá),UUO組IL-1β主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿。與Sham組大鼠比較,UUO組腎組織IL-1β表達(dá)明顯增強(qiáng);與UUO組大鼠比較,EPL組和TCM組腎組織IL-1β表達(dá)明顯減弱。8 Western Blot法檢測各組大鼠腎臟IL-1β蛋白表達(dá)比較:UUO組大鼠腎組織IL-1β表達(dá)明顯高于Sham組(P0.01);與UUO組大鼠比較,EPL組和TCM組腎組織IL-1β表達(dá)明顯降低(P0.01)。第二部分化瘀解毒中藥對梗阻性腎病大鼠腎臟細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)及NLRP3炎癥小體信號通路的影響目的:觀察梗阻性腎病模型大鼠腎臟NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡改變;觀察化瘀解毒中藥對梗阻性腎病時NLRP3-Caspase-1-IL-1β軸以及NLRP3-Caspase-1-Pyroptosis通路的影響;同時探討梗阻性腎病NF-κB與NLRP3信號通路的關(guān)系以及化瘀解毒中藥的影響;從而明確化瘀解毒中藥拮抗炎性損傷的分子機(jī)制,并尋找其作用靶點(diǎn)。方法:1動物分組、模型制備及藥物干預(yù)方法同第一部分。2檢測指標(biāo)與方法:TUNEL染色檢測腎臟組織細(xì)胞DNA損傷情況;HE染色觀察腎臟損傷細(xì)胞的形態(tài);Real time-PCR檢測腎臟NLRP3、Caspase-1、IL-1β及NF-κB m RNA表達(dá);SABC法檢測腎臟NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白表達(dá)并定位;Western blot法檢測腎臟NLRP3、Caspase-1、IL-1β及NF-κB蛋白表達(dá)并定量。3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同第一部分。結(jié)果:1各組大鼠腎臟組織細(xì)胞TUNEL染色陽性率比較:Sham組僅見少量TUNEL陽性細(xì)胞。與Sham組比較,UUO組細(xì)胞陽性率升高,以髓質(zhì)擴(kuò)張的遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞為主(P0.01)。與UUO組比較,EPL組和TCM組的遠(yuǎn)端小管TUNEL陽性細(xì)胞減少,陽性率降低(P0.05,P0.01)。2 UUO誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞損傷表現(xiàn)為多種病理形態(tài):胞核固縮或斷裂,胞膜無明顯變化,為凋亡(Apoptosis)細(xì)胞形態(tài)特征;胞核固縮或斷裂,胞漿腫脹,胞膜不完整,為焦亡(Pyroptosis)細(xì)胞形態(tài)特征;胞核腫脹或溶解,胞漿腫脹,胞膜不完整,為壞死(Necrosis)細(xì)胞形態(tài)特征。3各組大鼠腎臟NLRP3、Caspase-1 m RNA表達(dá)比較:與Sham組比較,UUO組腎臟NLRP3、Caspase-1表達(dá)升高(P0.01)。與UUO組比較,EPL組及TCM組NLRP3、Caspase-1表達(dá)降低(P0.01)。4 SABC法檢測UUO大鼠腎臟NLRP3、Caspase-1分子蛋白表達(dá):Sham組NLRP3表達(dá)不明顯,UUO組表達(dá)顯著增強(qiáng),主要表達(dá)于腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞,EPL組及TCM組表達(dá)較UUO組顯著減弱。Sham組Caspase-1呈弱表達(dá),UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng),主要見于腎小管上皮細(xì)胞胞漿,EPL組及TCM組較UUO組顯著減弱。5 Western blot檢測UUO大鼠腎臟NLRP3、Caspase-1分子蛋白表達(dá):Sham組NLRP3、Caspase-1分子均呈弱表達(dá),UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.01),EPL組及TCM組表達(dá)較UUO組明顯減弱(P0.01)。6各組大鼠腎臟IL-1β分子m RNA及蛋白表達(dá):見第一部分。7各組大鼠腎臟NF-κB m RNA及蛋白表達(dá):與Sham組比較,UUO組腎臟NF-κB m RNA表達(dá)升高(P0.01)。與UUO組比較,EPL組及TCM組NF-κB m RNA表達(dá)降低(P0.01)。Western blot結(jié)果顯示,Sham組大鼠腎臟NF-κB(p65)呈弱表達(dá),UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.01),EPL組及TCM組表達(dá)較UUO組明顯減弱(P0.01)。第三部分化瘀解毒中藥含藥血清對m DCT細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)及NLRP3炎癥小體信號通路的影響目的:觀察醛固酮誘導(dǎo)的m DCT細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β及NF-κB的表達(dá)情況,同時觀察m DCT細(xì)胞DNA損傷及膜損傷情況;以探索化瘀解毒中藥對m DCT細(xì)胞NF-κB-NLRP3-Caspase-1-IL-1β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞焦亡的影響;從而進(jìn)一步明確化瘀解毒中藥拮抗炎性損傷的分子機(jī)制及其作用靶點(diǎn)。方法:1含藥血清制備:10只SD大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組與中藥組,每組5只。中藥組給予化瘀解毒中藥煎劑13.7g/(kg·d);對照組給予等容量生理鹽水。每天1次,連續(xù)10天。末次給藥1h后腹主動脈采血,分離血清。2細(xì)胞培養(yǎng):腎小管上皮細(xì)胞m DCT培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液(含10%~20%胎牛血清,青霉素和鏈霉素各100單位/ml)中,置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中,隔日換液,待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后,制成單細(xì)胞懸液(4×104個/ml),接種于6孔板培養(yǎng)或分瓶培養(yǎng)24小時,換成無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時,使細(xì)胞同步化,而后加藥刺激24小時,收集細(xì)胞或上清液。3細(xì)胞分組:培養(yǎng)細(xì)胞分為五組:對照(Cont)組、醛固酮(ALD)組、依普利酮加醛固酮(EPL+ALD)組、正常血清加醛固酮(NS+ALD)組和含藥血清加醛固酮(DS+ALD)組。Cont組加入無藥培養(yǎng)液;其他各組均加入含1μM(終濃度)醛固酮的培養(yǎng)液;EPL+ALD組加入10μM(終濃度)的依普利酮作用30分鐘后再加入醛固酮培養(yǎng)液;NS+ALD組加入10%(終濃度)正常血清;DS+ALD組加入10%(終濃度)含藥血清。Western blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為四組:對照(Cont)組、醛固酮(ALD)組、依普利酮(EPL)組、中藥(TCM)組。Cont組加入無藥培養(yǎng)液;其他各組均加入含1μM(終濃度)醛固酮的培養(yǎng)液;EPL組加入10μM(終濃度)的依普利酮作用30分鐘后再加入醛固酮培養(yǎng)液;TCM組加入10%(終濃度)含藥血清;Cont、ALD及EPL組均加入10%(終濃度)正常血清。4檢測指標(biāo)與方法:采用免疫熒光染色/激光共聚焦顯微系統(tǒng)檢測醛固酮誘導(dǎo)的m DCT細(xì)胞NLRP3、Caspase-1及IL-1β表達(dá)情況;乳酸脫氫酶(LDH)實(shí)驗(yàn)檢測m DCT細(xì)胞的膜損傷情況;TUNEL染色檢測m DCT細(xì)胞的DNA損傷情況;Western blot檢測m DCT細(xì)胞NLRP3、Caspase1、IL-1β及NF-κB(p65)的表達(dá)。5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同第一部分。結(jié)果:1免疫熒光染色/激光共聚焦顯微系統(tǒng)檢測m DCT細(xì)胞NLRP3、Caspase-1及IL-1β表達(dá):DAPI使m DCT細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光,NLRP3、Caspase-1及IL-1β分子主要表達(dá)于細(xì)胞漿,呈橘紅熒光。結(jié)果證實(shí)經(jīng)醛固酮刺激后,細(xì)胞可見NLRP3、Caspase-1及IL-1β表達(dá)。2各組m DCT細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH含量比較:ALD組m DCT細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量明顯高于Cont組(P0.01);與ALD組比較,EPL+ALD組LDH含量明顯降低(P0.01);DS+ALD組LDH含量低于NS+ALD組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3各組m DCT細(xì)胞TUNEL染色陽性率比較:ALD組m DCT細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞增多,高于Cont組(P0.01);與ALD組比較,EPL+ALD組TUNEL陽性率降低(P0.05);與NS+ALD組比較,DS+ALD組TUNEL陽性率降低(P0.05)。4各組m DCT細(xì)胞NLRP3、Caspase-1及IL-1β表達(dá):與Cont組比較,ALD組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1及IL-1β表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.01);與ALD組比較,EPL組及TCM組表達(dá)明顯減弱(P0.01)。5各組m DCT細(xì)胞NF-κB(p65)表達(dá):Cont組細(xì)胞NF-κB分子均呈弱表達(dá),ALD組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.01),EPL組及TCM組表達(dá)較ALD組減弱(P0.05)。結(jié)論:1炎性損傷在梗阻性腎病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用,IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1等炎性因子參與這一過程。2細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)是梗阻性腎病的重要病理改變,與NLRP3活化相關(guān),通過NLRP3-Caspase-1-IL-1β/Pyroptosis通路誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。3化瘀解毒中藥減輕梗阻性腎病炎性損傷的機(jī)制與其下調(diào)NLRP3表達(dá)而抑制炎性因子分泌、并抑制Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)。4炎性細(xì)胞浸潤、炎性因子增多分別是腎病“濁毒”形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)、分子基礎(chǔ)之一;NF-κB-NLRP3-Caspase-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是腎病“濁毒”形成的分子機(jī)制之一。NLRP3可能是化瘀解毒中藥拮抗炎性損傷的靶點(diǎn)之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2303411