【摘要】：肝臟介導(dǎo)的藥物代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)在藥物引起的肝損傷以及藥物相互作用方面起著重要作用。藥物的代謝活化過程能夠產(chǎn)生反應(yīng)性中間體,這些中間體可以通過耗竭GSH引起氧化應(yīng)激,或與細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生共價結(jié)合,從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性;藥物或其代謝物若抑制膽汁酸的肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)過程,導(dǎo)致膽汁酸在肝臟中蓄積,則可能引發(fā)膽汁淤積型肝毒性。此外,藥物可以通過影響代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體活性,改變同服藥物的體內(nèi)處置過程,從而影響同服藥物的藥效或毒性。本論文擬以具有肝毒性的非甾體抗炎藥尼美舒利(NIM)為研究對象,利用各種代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)體研究模型,探索NIM基于代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)的肝毒性機(jī)制,并考察代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的NIM與臨床常用藥物的藥物相互作用,為尼美舒利的臨床合理用藥和安全性評價提供重要科學(xué)依據(jù)。1.NIM代謝活化與肝細(xì)胞毒性研究NIM是一種選擇性抑制環(huán)氧合酶Ⅱ的非甾體抗炎藥,臨床使用中有嚴(yán)重的肝損傷報(bào)道。已有文獻(xiàn)指出NIM硝基還原為氨基的代謝物M2在代謝酶的催化下能發(fā)生代謝活化,產(chǎn)生反應(yīng)性中間體,該過程被認(rèn)為與NIM的肝細(xì)胞毒性有關(guān)。然而,體外肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),M2在大鼠原代肝細(xì)胞中孵化24 h并不產(chǎn)生細(xì)胞毒性,而NIM能產(chǎn)生濃度依賴性的毒性,提示M2的代謝活化過程不是導(dǎo)致NIM肝細(xì)胞毒性的原因。因此,本研究的目的為考察NIM是否存在其它代謝活化途徑,并評價這些代謝活化途徑與NIM肝細(xì)胞毒性的關(guān)系。在包含NIM,NADPH和GSH的人或大鼠肝微粒體孵化體系中,共檢測到兩種GSH結(jié)合物。經(jīng)UPLC/Triple TOF MS法鑒定,一種為氧化脫硝基的GSH結(jié)合物(NIM-OH-GSH),另一種為硝基還原為氨基的GSH結(jié)合物(NIM-NH_2-GSH)。NIM-OH-GSH在以NIM為底物的孵化體系中的生成量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以氧化脫硝基代謝物NIM-OH為底物的孵化體系中的生成量,并且環(huán)氧化物水解酶能顯著抑制NIM-OH-GSH在NIM孵化體系中的生成,提示NIM-OH-GSH主要由NIM經(jīng)環(huán)氧化過程產(chǎn)生,而非NIM-OH直接氧化產(chǎn)生。酶表型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明CYP1A2是催化NIM氧化活化產(chǎn)生NIM-OH-GSH的主要酶。在包含NIM、NADPH和GSH的非酶孵化體系也能夠檢測到NIM-NH_2-GSH,提示NIM-NH_2-GSH可由NIM還原活化過程產(chǎn)生。生物還原劑NADPH和GSH均可以催化NIM的還原過程。此外,NIM-NH_2-GSH在胞漿孵化體系中的生成量要遠(yuǎn)高于非酶孵化體系中的生成量,且選擇性醛氧化酶(AO)抑制劑雌二醇能顯著抑制NIM-NH_2-GSH的生成,提示AO也參與NIM的還原活化過程。利用高分辨質(zhì)譜和核磁共振氫譜確定了NIM-NH_2-GSH的結(jié)構(gòu)。推測NIM的還原活化機(jī)制如下:在還原劑的催化下,硝基能被依次還原成亞硝基、羥胺和氨基;其中,亞硝基中間體不穩(wěn)定,能迅速與GSH反應(yīng),產(chǎn)生半縮硫醛中間體和磺酰胺中間體;后者發(fā)生重排產(chǎn)生NIM-NH_2-GSH。NIM在人和大鼠原代肝細(xì)胞中孵化24 h產(chǎn)生濃度依賴性的細(xì)胞毒性,IC50值分別為213和40μM。向肝細(xì)胞中加入非特異性CYP抑制劑1-氨基苯并三唑和AO抑制劑雌二醇分別抑制NIM的氧化和還原活化過程后,NIM的細(xì)胞毒性并未降低。此外,GSH耗竭劑丁硫氨酸(BSO)也未能增加NIM的細(xì)胞毒性。以上結(jié)果表明NIM的氧化和還原活化過程不會導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性,NIM自身濃度與肝細(xì)胞毒性密切相關(guān)。2.基于轉(zhuǎn)運(yùn)體的NIM膽汁淤積型肝毒性機(jī)制研究除了肝細(xì)胞毒性,膽汁淤積型肝毒性也是NIM臨床上肝毒性的一種重要表現(xiàn)形式。目前,NIM產(chǎn)生膽汁淤積型肝毒性的機(jī)制尚不清楚。大量文獻(xiàn)報(bào)道藥物或其代謝物抑制膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能,可能導(dǎo)致膽汁淤積型肝毒性。因此,本研究考察了NIM在大鼠體內(nèi)的膽汁淤積型肝毒性,并利用大鼠和人肝細(xì)胞三明治模型以及懸浮大鼠肝細(xì)胞評價了NIM及其主要代謝物對膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響。Wistar大鼠連續(xù)5天灌胃給予100 mg/kg/day NIM后,血漿中的總膽汁酸(TBA)、堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平分別增加為對照組的1.49、1.31、1.60和1.29倍。血漿中的膽酸(CA)、去氧膽酸(DCA)、鵝去氧膽酸(CDCA)和熊去氧膽酸(UDCA)水平顯著升高;肝臟中CA、CDCA和甘氨鵝去氧膽酸(GCDCA)水平也顯著升高。利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定了最后一次給藥24 h后大鼠血漿和肝臟中NIM及其代謝物的濃度。血漿中NIM、羥基化代謝物M1、硝基還原為氨基代謝物M2和進(jìn)一步乙�；x物M4的濃度分別為45.4、21.0、0.037和0.180μM;肝臟中NIM、M1、M2和M4的濃度分別為17.3、23.6、1.8和13.4μM。在大鼠肝細(xì)胞三明治模型中,NIM和M1濃度依賴性地降低了d8-TCA的膽汁排泄系數(shù)(BEI)和體外膽汁清除率(Clbiliary),并且Clbiliary的降低程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于BEI的降低,提示NIM和M1能抑制BSEP介導(dǎo)的d8-TCA外排進(jìn)入膽汁的過程,并且對d8-TCA攝取過程的抑制要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對其外排過程的抑制。進(jìn)一步考察了NIM和M1分別對NTCP和OATPs介導(dǎo)的d8-TCA攝取進(jìn)入肝細(xì)胞的抑制作用。NIM和M1抑制NTCP-介導(dǎo)的的d8-TCA攝取的IC50分別為21.3和25.0μM,抑制OATP-介導(dǎo)的的d8-TCA攝取的IC50分別為45.6和39.4μM。此外,NIM和M1還濃度依賴性地降低了CDF的BEI值,提示NIM和M1能抑制MRP2介導(dǎo)的CDF外排進(jìn)入膽汁的過程。還原型代謝物M2和M4不抑制或僅輕微抑制上述轉(zhuǎn)運(yùn)體。在人肝細(xì)胞三明治模型中,也得到與大鼠肝細(xì)胞類似的結(jié)果,提示NIM和M1能抑制人的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。本研究結(jié)果表明NIM和羥基化代謝物M1能抑制膽汁酸的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體NTCP和OATPs,以及外排轉(zhuǎn)運(yùn)體BSEP和MRP2,導(dǎo)致體內(nèi)膽汁酸水平出現(xiàn)紊亂。NIM和M1對膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用可能是NIM產(chǎn)生膽汁淤積型肝毒性的一種原因。3.基于轉(zhuǎn)運(yùn)體的NIM和對乙酰氨基酚藥物相互作用研究有文獻(xiàn)報(bào)道小鼠同時給予NIM和對乙酰氨基酚(PA)可產(chǎn)生協(xié)同的鎮(zhèn)痛作用。PA臨床過量使用可產(chǎn)生嚴(yán)重的肝損傷,其肝毒性被認(rèn)為與CYP450介導(dǎo)的代謝活化過程有關(guān)。曲格列酮可通過誘導(dǎo)大鼠肝臟CYP3A活性增加PA的代謝活化程度,使得PA在大鼠體內(nèi)的肝毒性增加。此外,PA-Glu是肝臟膽管側(cè)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2及基底側(cè)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP3的底物,轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的改變會影響PA和PA-Glu的肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)過程。本研究的主要目的為考察NIM是否會通過改變代謝酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體活性來影響PA的體內(nèi)處置過程,從而影響PA的肝毒性和療效。Wistar大鼠連續(xù)5天灌胃給予100 mg/kg/day NIM后,PA的t1/2、MRT和AUC分別降低了69%、65%和53%,而tmax和Cmax無明顯改變;PA-Glu的t1/2和MRT分別降低了72%和54%,Cmax和AUC分別增加了2.59倍和0.85倍,而tmax無明顯改變。NIM多次給藥后,PA在大鼠0-24 h尿中的累積排泄量顯著降低,而PA-Glu的累積排泄量未發(fā)生明顯改變。此外,PA和PA-Glu在NIM組大鼠體內(nèi)的膽汁排泄量均顯著降低。單次灌胃給予100 mg/kg/day NIM,PA及PAGlu在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)基本不變。在對照組和NIM組大鼠肝微粒體孵化體系中,4-MU和PA的葡萄糖醛酸結(jié)合物的生成量無明顯差別,提示NIM多次給藥不影響大鼠肝臟的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性。與對照組相比,NIM組大鼠肝臟MRP2的mRNA水平降低了51%,而MRP3的mRNA水平增加了7.42倍。上述結(jié)果提示NIM對MRP2的抑制以及對MRP3的誘導(dǎo),使得PA-Glu腸肝循環(huán)過程受到抑制,導(dǎo)致PA-Glu系統(tǒng)暴露量增加,而PA系統(tǒng)暴露量降低。NIM組大鼠0-24 h尿中與代謝活化過程相關(guān)的代謝物PA-cys和PA-NAC的累積排泄量較對照組分別降低了76%和75%,提示PA的代謝活化過程減少,從而PA在NIM組大鼠體內(nèi)肝毒性降低。4.基于醛氧化酶的NIM和甲氨蝶呤藥物相互作用研究近期一項(xiàng)研究表明青少年患者同時服用NIM和甲氨蝶呤(MTX)會顯著增加肝損傷風(fēng)險。MTX在體內(nèi)主要由醛氧化酶(AO)催化產(chǎn)生7-OH MTX,后者在大鼠體內(nèi)的毒性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于MTX,因此推測NIM可能誘導(dǎo)了AO,導(dǎo)致毒性代謝物7-OH MTX生成量增加。Wistar大鼠連續(xù)5天灌胃給予100 mg/kg/day NIM后,MTX的Cmax和AUC分別增加了0.66和1.05倍,7-OH MTX的Cmax和AUC分別增加了3.31和5.49倍。給予MTX 4 h后,NIM組大鼠肝臟中MTX的含量較對照組降低了34%,而7-OH MTX的含量則增加了1.51倍。此外,MTX和7-OH MTX在NIM組大鼠0-24 h尿中的累積排泄量較對照組分別增加了0.80和4.19倍,7-OH MTX在0-24 h糞中的累積排泄量也增加了1.08倍。MTX在不同組大鼠0-24 h糞中的累積排泄量無明顯差別,這是因?yàn)榇蟛糠諱TX未經(jīng)吸收而直接排入糞中。NIM能劑量依賴性的增加大鼠肝臟AO活性。與對照組相比,7-OH MTX在20、50和100 mg/kg/day劑量組大鼠肝胞漿孵化體系中的生成量分別增加了0.90、2.16和2.66倍。SGX523、JNJ-38877605和NIM在100 mg/kg/day劑量組大鼠肝胞漿孵化體系中經(jīng)AO催化產(chǎn)生的代謝物含量較對照組也分別增加了2.36、2.84和1.69倍。RT-PCR和Western Blot結(jié)果表明大鼠肝臟AOX1和AOX3的mRNA水平無明顯改變,但AOX1的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)出劑量依賴性的增加,AOX3的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)出劑量依賴性的降低。體外肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也表明NIM能誘導(dǎo)大鼠和人肝細(xì)胞的AO活性。與對照組相比,10、20和50μM NIM使7-OH MTX在大鼠肝細(xì)胞中的生成量分別增加了0.50、1.80和3.89倍,10μM NIM使7-OH MTX在人肝細(xì)胞中的生成量增加了0.75倍。本研究證明NIM能誘導(dǎo)AO,導(dǎo)致MTX的毒性代謝物7-OH MTX生成量增加,進(jìn)而可能增加MTX的肝毒性風(fēng)險。5.結(jié)論本論文以具有肝毒性的非甾體抗炎藥NIM為研究對象,系統(tǒng)研究了其基于代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的肝毒性機(jī)制和藥物相互作用。NIM的肝毒性與其代謝活化過程無關(guān),但NIM本身及其羥基化代謝物對膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體NTCP、OATPs、BSEP和MRP2的抑制,是導(dǎo)致其膽汁淤積型肝毒性的原因之一。NIM對MRP2的抑制以及對MRP3的誘導(dǎo)也會使臨床常用藥物對乙酰氨基酚主要代謝產(chǎn)物葡萄糖醛酸結(jié)合物的肝腸循環(huán)過程受抑制,導(dǎo)致原形藥物的體循環(huán)含量降低,進(jìn)而降低其藥效。NIM也能通過誘導(dǎo)AO增加甲氨蝶呤毒性代謝物7-羥基甲氨蝶呤的生成,進(jìn)而增加甲氨蝶呤的肝毒性風(fēng)險。本論文結(jié)果提示肝臟介導(dǎo)的藥物代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)在藥物引起的肝毒性以及藥物相互作用方面起著重要作用。在藥物的開發(fā)階段,除了鑒定穩(wěn)定代謝產(chǎn)物,以及考察對常規(guī)代謝酶(如CYP450酶)和轉(zhuǎn)運(yùn)體(如P-gp和BCRP)的抑制和誘導(dǎo)作用外,還應(yīng)關(guān)注反應(yīng)性代謝產(chǎn)物,以及對特殊代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體,如AO和MRP2,的影響,以避免藥物在臨床使用中出現(xiàn)不良反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海藥物研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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本文編號：2297021