【摘要】：1.研究目的和意義動脈粥樣硬化是一種進行性疾病,其特征是脂類的積累和大動脈血管纖維元素。慢性炎癥在動脈粥樣硬化的發(fā)展起著重要的作用。激活的白細胞、內皮細胞和巨噬細胞產(chǎn)生促炎細胞因子包括IL-1β,IL-6、以及TNF-α以及抗炎細胞因子,如IL-10。從中草藥、植物中尋找有效且毒副作用反應小的抗動脈粥樣硬化的藥物靶點,可成為新世紀國內外學者研發(fā)抗血脂藥物的新方向。已證實香芹酚具有多方面的藥理特性且對人體正常細胞毒性最小。已有多項實驗研究表明香芹酚具有抗炎、抗動脈粥樣硬化內膜增生的作用。但具體的作用機制尚未清楚。本研究探索香芹酚對(ox-LDL)誘導細胞自噬的影響,并初步探討其可能的分子機制。2、方法1、體外培養(yǎng)氧化低密度脂蛋白誘導的TPH-1細胞成泡沫細胞,然后用不同濃度的香芹酚(終末濃度為0.1、1.0、5.0、10uM)處理巨噬細胞RAW246.7細胞24 h,檢測隨著香芹酚的濃度的增加觀察其抗增殖效應和誘導凋亡效應。THP-1細胞采用PRMI-1640培養(yǎng)基和10%無支原體新生小牛血清作為補充培養(yǎng)液,置于37 'C、5%C02的細胞培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期細胞進行實驗,實驗前用100nM佛波醋(PMA)培育THP-1細胞24h,使其誘導分化成巨噬細胞,更換培養(yǎng)基后加不同濃度梯度的Ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)48h,使其轉化成泡沫細胞。2、觀察香芹酚對氧化低密度脂蛋白誘導的TPH-1細胞成泡沫細胞的凋亡作用.Hoechst33258染色法檢測RAW246.7細胞增殖凋亡。分別使用P38-MAPK信號通路特異性阻抗劑SB203580阻斷P38-MAPK信號通路和ERK/MAPK信號通路特異性阻斷劑U0216阻斷ERK/MAPK信號通路,檢測細胞的活性和表達關系。實驗分組如下:(1)、香芹酚作用組:分別以不同組分香芹酚作用RAW264.7細胞24,48h,設空白對照組和藥物組,觀察香芹酚對RAW264.7細胞炎癥定性率及穩(wěn)定性蛋白的影響;通過Western Blot在RAW264.7細胞中15分鐘檢測香芹酚對磷酸化蛋白質及其總蛋白表達的MAPK信號通路的影響。(2)、抑制劑組:分別以20MU0126A(ERKl/2特異性抑制劑)及10M SB203580B(P38特異性抑制劑)作用RAW264.7細胞48,24h,空白對照是以相應條件下不加抑制劑的RAW264.7細胞,觀察其對RAW264.7細胞炎癥及斑塊穩(wěn)定性形態(tài)的影響。(3)、香芹酚和抑制劑聯(lián)合組:為觀察特異性抑制MAPK信號轉導通路對香芹酚抑制RAW264.7細胞炎癥影響。用5uM香芹酚,10MU0126及10MSB203580聯(lián)合作用于RAW264.7細胞24h,抑制劑提前于香芹酚1h加入。3、通過油紅0染色顯示細胞內脂滴的狀態(tài),檢測香芹酚抑制泡沫細胞形成細胞接種于培養(yǎng)板內,oxldl誘導建模成功后,檢測不同香芹酚濃度抑制泡沫細胞水平。4、觀察香芹酚是否抑制ox-LDL誘導的LOX-1表達取細胞的總RNA進行RT-PCR,檢測不同濃度Carvacrol組LOX-1蛋白水平。5、Western Blot法分析香芹酚對氧化低密度脂蛋白誘導的TPH-1細胞成泡沫細胞泡沫化中凋亡及NFkB蛋白的各種磷酸化形式Western Blot法包括1、灌膠與上樣2、電泳3、轉膜4、封閉5、免疫反應6、觀察香芹酚抑制Ox-LDL誘導的炎癥因子分別以香芹酚1uM,5uM,10uM三個濃度梯度的Carvacrol處理Ox-LDL作用下THP-1巨噬細胞48小時后,用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-a、IL6、IL-1beta。7、觀察香芹酚對氧化低密度脂蛋白誘導的細胞自噬的影響。通過電鏡檢測及WesternBlot檢測其香芹酚對氧化低密度脂蛋白誘導的TPH-1細胞成泡沫細胞泡沫化和大鼠RAVSMCs的自噬變化。(1)選取SD大鼠最好150-180g,組織培養(yǎng)血管分為空白對照組(只含1%雙抗的無血清的DMEM培基)、香芹酚干預組(MCP1終濃度為1OOng/ml)。同時留取部分新鮮血管環(huán)于液氮中凍存。WesternBlot檢測其香芹酚對自噬相關蛋白mTOR、p62、LC3Ⅱ和LAMP-2蛋白的表達水平。3、結果1、MTT檢測用不同濃度的香芹酚(終末濃度為0.1、1.0、5.0、10 uM)處理巨噬細胞RAW246.7細胞24h后香芹酚的濃度的增加其增殖活性未見明顯變化,與空白對照組相比較,組間比較差異無統(tǒng)計學意義顯著(P0.05);用香芹酚(終末濃度為0.1、1.0、5.0、10mM)處理oxldl刺激后24 h,隨著香芹酚的濃度的增加其增殖活性未見明顯變化,組間比較差異無統(tǒng)計學意義顯著(P0.05)2、香芹酚在體外實驗中對巨噬細胞系RAW246.7細胞的泡沫化具有明顯的抑制作用Hoechst33258核染色分析顯示經(jīng)不同濃度的香芹酚處理后的RAW246.7細胞24小時后均呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征,隨著濃度的增加,細胞數(shù)量逐漸減少,呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀態(tài)的凋亡細胞數(shù)增加,明顯的細胞碎片形成。核染色的結果顯示:阻斷ERKMAPK信號轉導通路后,并沒改變RAW246.7細胞凋亡情況,而阻斷p38MAPK信號轉導通路后RAW246.7細胞凋亡明顯減少。3、香芹酚抑制泡沫細胞脂滴含量:通過顯微鏡觀察,control組胞漿中紅色脂迪數(shù)量很少,胞漿中只有可見數(shù)顆脂滴。ox-LDL處理組細胞胞漿中有大量紅色脂滴,紅色脂滴約占細胞體積的50%以上。與control組相比,經(jīng)香芹酚(CAR)孵育后,胞內脂滴含量較ox-ldl處理組組胞內脂滴逐漸減少,并隨著濃度的增加胞內脂滴數(shù)目減少。4、香芹酚抑制ox-LDL誘導的LOX-1表達;與control組相比,不同濃度Carvacrol組LOX-Ⅰ蛋白水平明顯降低,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。且濃度越高,Lox-Ⅰ蛋白水平越低。Carvacrol組LOX-Ⅰ蛋白水平與ox-LDL組相比差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。但Carvacrol 1uM組與ox-LDL組相比,無統(tǒng)計學意義(p0.05)。5、香芹酚抑制ox-LDL誘導泡沫細胞炎癥因子表達:Ox-LDL刺激細胞后,細胞上清液中的TNF-a、IL6、IL-1 beta,與對照組相比有顯著統(tǒng)計學意義(P0.05vs control)。而Carvacrol處理后隨著濃度的增加,炎癥因子TNF-a、IL6、IL-1beta相對下降,均與對照組相比有顯著統(tǒng)計學意義(p0.05 vs oxldl組)6、香芹酚抑制泡沫細胞LPS誘導的炎癥細胞因子的表達RAW246.7經(jīng)LPS組處理后TNF-a,IL-1beta、IL-6水平顯著高于其他組別,CAR處理后能抑制LPS誘導的TNF-a的增加(p0.01)如圖LPS組處理后TNF-a,IL-beta、IL-6水平顯著高于其他組別,CAR處理后能抑制LPS誘導的TNF-a的增加(p0.01)。7、香芹酚影響對經(jīng)ox-LDL誘導的單核-巨噬細胞自噬相關蛋白mTOR、p62表達與control組相比,ox-ldl處理組組中mTOR蛋白表達水平顯著增加(P0.05)水平。與ox-ldl組相比,三個劑量香芹酚干預均可使mTOR蛋白表達進一步下降,其中10uMCAR組顯著低于ox-ldl組的。各組的p62蛋白表達趨勢與mTOR基本一致。與ox-Idl組相比,ox-ldl +中劑量組和ox-ldl +香芹酚高劑量組組的p62蛋白表達分別下降,且均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),ox-ldl組LC3 Ⅱ蛋白表達低于control組,但無統(tǒng)計學差異。和ox-ldl組相比,香芹酚可上調LC-3Ⅱ蛋白表達,其中ox-ldl+中劑量組LC3Ⅱ表達上調,ox-ldl+香芹酚高劑量組上調,且均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.結論(1).香芹酚在體外實驗中對巨噬細胞系RAW246.7細胞的泡沫化具有明顯的抑制作用;香芹酚調節(jié)泡沫細胞凋亡可能與p38MAPK信號轉導通路相關;(2).香芹酚抑制泡沫細胞脂滴含量;(3).香芹酚抑制ox-LDL誘導的LOX-1表達;(4).香芹酚抑制ox-LDL誘導泡沫細胞炎癥因子表達;(5).香芹酚抑制ox-LDL對NF-κB的激活;(6).香芹酚抑制泡沫細胞LPS誘導的炎癥細胞因子的表達;(7).香芹酚可降低主動脈平滑肌細胞mTOR、p62和LAMP-2的表達,.香芹酚影響對經(jīng)ox-LDL誘導的單核-巨噬細胞自噬相關蛋白mTOR、p62 表達。綜上所述,香芹酚(CAR)可能通過調節(jié)巨噬細胞凋亡增殖,抑制炎癥的方式減少泡沫細胞形成,以及調節(jié)自噬-溶酶體代謝LC3,從而發(fā)揮動脈粥樣硬化的保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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1 楊溶海;香芹酚對巨噬細胞泡沫化的影響及其在RASMCs中的自噬機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2017年

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本文編號：2276340