【摘要】：研究背景帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種世界第二大類并與年齡密切相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。65歲以上人群中發(fā)病率是1～2%,85歲以上為4～5%。并且隨著人口老齡化,PD的患病人數(shù)每年都在遞增。PD的臨床癥狀主要包括靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢步態(tài)障礙等運(yùn)動(dòng)癥狀,以及嗅覺障礙、便秘、神經(jīng)精神障礙、認(rèn)知障礙、自主神經(jīng)功能障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀。隨著疾病的發(fā)展,大多數(shù)患者最終將失去生活自理能力,嚴(yán)重影響了患者的日常生活和工作,給家庭和社會帶來不可估量的負(fù)擔(dān)。目前,診斷治療PD面臨的難題主要有:(1)發(fā)病機(jī)制不清:PD的發(fā)病受多種因素影響,目前認(rèn)為主要是在老齡化的基礎(chǔ)上,遺傳和環(huán)境共同作用造成的。許多研究顯示PD患者黑質(zhì)多巴胺能(DA)神經(jīng)元變性可能與線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、興奮性毒性、免疫調(diào)節(jié)異常、細(xì)胞調(diào)亡等一系列機(jī)制有關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,約有5～10%的帕金森病患者有家族史。但只有6個(gè)被證實(shí)能夠引起遺傳性單基因突變,表明帕金森病的發(fā)病與遺傳因素密切相關(guān)。(2)缺乏客觀的實(shí)驗(yàn)室診斷方法:PD異質(zhì)性高,目前除了影像方法輔助以外,統(tǒng)一帕金森病評分量表(The Unified Parkinson's Disease Rating Scale,UPDRS)和Hoehn-Yahr分級量表是PD臨床診斷和評估治療的常用方法。根據(jù)英國腦庫的帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn),患者有少動(dòng),再加上靜止性震顫、肌強(qiáng)直、姿勢步態(tài)異常三種癥狀中的一種,即可診斷為PD。但是由于發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性,不同患者的臨床癥狀、體征可能有所不同,而且同一患者在不同時(shí)間的病情也會有變化,且評定結(jié)果常常受患者及醫(yī)生的主、客觀因素的影響,使得結(jié)果缺乏可比性,給臨床診斷帶來困難。因此,篩選出PD相關(guān)的生物標(biāo)記物對于揭示其發(fā)病機(jī)制并開發(fā)出客觀的診斷方法,進(jìn)而達(dá)到疾病預(yù)防、控制和治療的目的具有重要意義。MicroRNA(miRNA)是長度為19-23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈短序列非蛋白編碼RNAs,與宿主基因共轉(zhuǎn)錄,參與了大約1/3基因的表達(dá),廣泛存在于真核生物中,是調(diào)節(jié)其他功能基因表達(dá)的重要調(diào)控分子,并參與多種細(xì)胞過程的調(diào)節(jié),例如生成、分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡,其異常調(diào)節(jié)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)病,包括癌癥和神經(jīng)變性疾病。在成熟的和非成熟的大腦中,在不同腦區(qū)和不同細(xì)胞種類中,miRNAs的表達(dá)水平非常高,某些miRNA出現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)如突觸,樹突和軸突等特定位置。它們能夠提高細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng),調(diào)整很多與突觸可塑性相關(guān)的參數(shù)。相比于蛋白質(zhì),miRNA是一種更容易穿過血腦、胎盤等屏障,以及存在于體液中的小分子。目前已經(jīng)在胞漿、血清、尿液、唾液和乳汁中檢測到脫落細(xì)胞的miRNA,這些miRNA受外切體和其他微粒的膜、蛋白質(zhì)、液體等分子的保護(hù)。由于凋亡小體的出現(xiàn)、微泡的出芽和脫落、高密度脂蛋白質(zhì)的主動(dòng)分泌等過程導(dǎo)致miRNA向細(xì)胞外釋放,隨后由于細(xì)胞死亡,miRNA出現(xiàn)在體液中所有形式的脫落細(xì)胞中。miRNA在血液和其他體液中呈高度穩(wěn)定性。miRNA的分泌具有選擇性,可以因不同的病理過程發(fā)生明顯改變。其易于檢測的特點(diǎn),提示了其作為疾病診斷標(biāo)志物的廣泛前景。研究表明PD是一種腦部病變疾病,因此腦組織是反映該疾病本質(zhì)最好的組織樣本。然而,由于腦組織的特殊性,同時(shí)PD至今沒有十分明確的致病腦區(qū),只能尸檢取腦組織作為研究對象,使得腦組織的相關(guān)生物標(biāo)記物很難在實(shí)際臨床診斷中得以應(yīng)用。眾所周知,腦脊液與腦組織每時(shí)每刻都在進(jìn)行著分子交換,能及時(shí)、較為準(zhǔn)確、動(dòng)態(tài)地反映腦組織的一些變化。在PD的生物標(biāo)記物的研究中,很多學(xué)者以腦脊液為生物樣本,但是由于采用腰椎穿刺的方法取腦脊液存在著患者被感染和出血等風(fēng)險(xiǎn),較難被病人接受。由于miRNAs在血液血漿或血清中穩(wěn)定存在,使用當(dāng)今敏感的分析方法,可在低濃度時(shí)可靠地檢測到,因此,研究血清miRNA是一種無創(chuàng)的早期診斷和預(yù)后評價(jià)的良好樣本。目的篩選出PD患者血清特異性miRNA表達(dá)譜,并對篩選出的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證,初步判斷其在PD發(fā)病中的可能作用。為尋找PD的血清miRNA的生物標(biāo)記物提供依據(jù),評價(jià)其對PD的診斷價(jià)值。方法1.樣本采集:根據(jù)英國PD腦庫診斷標(biāo)準(zhǔn),并且根據(jù)統(tǒng)一帕金森病評分量表的標(biāo)準(zhǔn)(UPDRS)和改良的HoehnYahr分級法以及磁共振成像和神經(jīng)心理學(xué)測試給予診斷選出138例帕金森患者。選擇年齡、性別匹配的正常志愿者112例為對照組。2.Solexa測序:運(yùn)用Solexa測序技術(shù)檢測12例PD患者以及12例健康對照組組成的混合血清中miRNA的表達(dá)量,初步篩選出PD組與健康對照組表達(dá)有顯著差異的miRNAs。3.驗(yàn)證:運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitive realtime PCR,qRT-PCR)技術(shù)驗(yàn)證PD組138例和健康對照組112例初篩的miRNAs。4.進(jìn)一步驗(yàn)證:運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證復(fù)篩得到的PD患者中有顯著差異的miRNAs,最后通過Spearman秩相關(guān)分析以及ROC曲線評價(jià)其臨床診斷價(jià)值。結(jié)果1.Solexa測序結(jié)果:Solexa測序篩選出16種miRNAs,PD組與健康對照組表達(dá)有顯著差異,分別為 miR-141,miR-146a-5p,miR-193a-3p,miR-214,miR-133b,miR-15b,miR-181a,miR-185,miR-195,miR-221,miR-29c,miR-29a,miR-19b,miR-24,miR-34b,miR-148b。2.驗(yàn)證:運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對16種miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)4種miRNAs在PD患者血清中的表達(dá)與健康人血清有顯著差異,分別是miR-29c,miR-146a,miR-214 和 miR-221。3.進(jìn)一步驗(yàn)證:運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對這4種miRNAs進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果顯示PD患者血清中miR-29c,miR-146a,miR-214和miR-221的表達(dá)較健康人均下調(diào)。(1)經(jīng)過秩檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-221檢測結(jié)果與UPDRS-Ⅲ量表得分的相關(guān)系數(shù)為0.4702,其P值小于0.0001;同時(shí),還發(fā)現(xiàn)其與UPDRS-V量表得分的相關(guān)系數(shù)為 0.4788,P 值小于 0.0001。miR-221 基因與 UPDRS-Ⅲ和 UPDRS-Ⅴ量表評分有正相關(guān)性,并且都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)經(jīng)過秩檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-29c,miR-146a,miR-214檢測結(jié)果與UPDRS-Ⅲ量表得分的相關(guān)系數(shù)分別為0.1218,0.1669,0.1931,其p值均大于0.05;同時(shí),還發(fā)現(xiàn)其與UPDRS-Ⅴ量表得分的相關(guān)系數(shù)分別為0.3333,0.1394,0.5476,p值均大于0.05。所以miR-29c,miR-146a,miR-214對于PD的預(yù)測效應(yīng)均尚不具備科學(xué)意義。(3)我們也驗(yàn)證了 4 中 miRNA 的 ROC 曲線(Receiver Operating Characteristic Curve)下面積,其中miR-221的曲線下面積最大為0.8639± 0.00223,而且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其他三種結(jié)果如下,miR-29c的曲線下面積為0.7565± 0.0333,miR-146a的曲線下面積為0.5752± 0.0373,miR-214的曲線下面積為0.8240± 0.0288。結(jié)論P(yáng)D患者和健康人血清中存在著豐富而且穩(wěn)定的各種miRNAs,患者血清miRNA的表達(dá)譜與健康人之間存在顯著差異,我們的研究結(jié)果顯示miR-29c,miR-146a,miR-214和miR-221在PD患者血清中的表達(dá)較健康人顯著下調(diào),然而,miR-221基因與UPDRS-Ⅲ和UPDRS-Ⅴ量表評分有正相關(guān)性,且ROC曲線下面積具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清miR-221可能成為診斷PD潛在的生物標(biāo)記物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5

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本文編號：2268992