【摘要】：研究背景：心血管疾病已經(jīng)成為危脅人類健康的首位疾病。血管疾病常為始發(fā)原因,而且缺乏有效的治療手段。血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)異常對(duì)血管病的形成,發(fā)展和疾病預(yù)后起重要作用。目前關(guān)于血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)的研究主要集中在正常血管中成熟的收縮型血管平滑肌細(xì)胞,然而,血管受到損傷后,另一類型的血管平滑肌細(xì)胞,即合成型平滑肌細(xì)胞越來越受關(guān)注。與收縮型平滑肌細(xì)胞相比,合成型平滑肌細(xì)胞的特點(diǎn)表現(xiàn)為生長(zhǎng)快,分泌多種細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子從而引起血管損傷。然而,關(guān)于合成型平滑肌細(xì)胞的來源至今尚未闡明。目前,公認(rèn)的觀點(diǎn)是,血管損傷后,合成型平滑肌細(xì)胞來源于位于血管中膜的成熟的收縮型平滑肌細(xì)胞去分化或表型修飾。另有觀點(diǎn)認(rèn)為合成型平滑肌細(xì)胞來自骨髓來源干細(xì)胞和血管局部存在的自身干細(xì)胞。顯然,骨髓來源干細(xì)胞對(duì)血管損傷的影響主要局限在早期的炎癥反應(yīng)階段,其分化為合成型平滑肌細(xì)胞的概率極低。因而,合成型平滑肌細(xì)胞更有可能來源于局部血管壁。也就是說,合成型平滑肌細(xì)胞可能來源于收縮型平滑肌細(xì)胞去分化或者局部存在的血管自身干細(xì)胞,然而,兩者的貢獻(xiàn)大小尚無文獻(xiàn)報(bào)道。有趣的是,近期一篇報(bào)道引起了廣泛關(guān)注：血管中膜存在一群(10%)SM-MHC(-)干細(xì)胞,稱為中膜多能血管干細(xì)胞(MVSCs),該細(xì)胞通過激活并分化為合成型平滑肌細(xì)胞,而不是成熟平滑肌細(xì)胞去分化,引起血管病變。盡管未采用條件性平滑肌細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)(lineage tracing)來追蹤血管平滑肌細(xì)胞的最終命運(yùn),但是,該研究再次強(qiáng)調(diào)了系統(tǒng)研究平滑肌細(xì)胞來源的重要性和細(xì)胞體內(nèi)譜系示蹤研究對(duì)血管病理研究的重要意義。研究目的：研究大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞來自中膜多能血管干細(xì)胞的分化,闡明中膜多能血管干細(xì)胞向合成型平滑肌細(xì)胞分化的分子機(jī)制。研究方法：1.大鼠中膜多能血管干細(xì)胞(MVSCs)培養(yǎng)：采用酶消化法分離和原代培養(yǎng)大鼠中膜多能血管干細(xì)胞,分別采用干細(xì)胞培養(yǎng)體系和普通培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng),傳代。2.細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)：采用PDGF-BB誘導(dǎo),使維持于干細(xì)胞培養(yǎng)基中的大鼠中膜多能血管干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化；分別采用相應(yīng)的誘導(dǎo)因子使大鼠中膜多能血管干細(xì)胞向骨,軟骨和脂肪分化。3.基因干擾：采用RNAi方法,抑制細(xì)胞內(nèi)Pla2g7或NEDD8基因表達(dá)。4. Real-time RT-PCR:不同條件下獲得的細(xì)胞使用TRIzol法提取總RNA,采用Real-time RT-PCR檢測(cè)相應(yīng)基因mRNA表達(dá)水平的變化。5. Western blot實(shí)驗(yàn)：采用蛋白裂解液裂解不同條件下獲得的細(xì)胞,BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。獲得的蛋白裂解產(chǎn)物用SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳后檢測(cè)相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)水平。6.免疫熒光染色：細(xì)胞接種于預(yù)先鋪細(xì)胞爬片的六孔板內(nèi)培養(yǎng),行相應(yīng)刺激后,固定、封閉后先后加入相應(yīng)一抗和熒光二抗孵育,采用激光共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡觀測(cè)相應(yīng)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。7.流式細(xì)胞術(shù)：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白的表達(dá)。8.[3H]胸腺嘧啶摻入法：[3H]胸腺嘧啶摻入法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。9.活性氧(ROS)測(cè)定：細(xì)胞內(nèi)ROS水平采用DCHF探針結(jié)合后,共聚焦顯微鏡檢測(cè)ROS生成,圖像采用IPP軟件計(jì)算。10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次,結(jié)果采用單因素方差分析或Holm's t檢驗(yàn)。P0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：1.從大鼠胸主動(dòng)脈新分離培養(yǎng)的中膜多能血管干細(xì)胞(MVSCs)表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志,在傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系(RGM)而不是在干細(xì)胞培養(yǎng)體系(SCGM)中能快速分化為合成型血管平滑肌細(xì)胞：(1)與培養(yǎng)條件無關(guān),僅有少量新分離的細(xì)胞可貼壁存活并生長(zhǎng)。與成熟的收縮型平滑肌細(xì)胞相比,該細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志,包括aSMA, SM22a, hl-calponin和smoothelin表達(dá)水平極低。(2)RGM培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)歷向合成型血管平滑肌細(xì)胞的分化,即aSMA, SM22a, h1-calponin和smoothelin表達(dá)水平逐漸增高。(3) SCGM培養(yǎng)的細(xì)胞,其干細(xì)胞標(biāo)志(NFM, Sox10和S100p)的mRNA水平在培養(yǎng)的早期先上調(diào)后下降,最終回到基礎(chǔ)水平；而RGM培養(yǎng)的細(xì)胞,其干細(xì)胞標(biāo)志的mRNA水平與新分離的細(xì)胞相比,未發(fā)生改變。(4)免疫熒光染色的結(jié)果顯示,幾乎所有SCGM培養(yǎng)的P1代細(xì)胞均表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志NFM, Sox10和S100β。Western blot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,SCGM和RGM培養(yǎng)的A1代和P1代細(xì)胞均高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志NFM, Sox10和S100p,其表達(dá)水平在SCGM和RGM培養(yǎng)中逐漸下降,但在RGM培養(yǎng)時(shí)下降水平更為顯著。(5)新分離的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志CD29, CD90和CD44H,其表達(dá)水平在RGM培養(yǎng)至第10代未見下降。2. SCGM培養(yǎng)的MVSCs細(xì)胞具有多能性：(1) PDGF-BB顯著上調(diào)了SCGM培養(yǎng)的P2代MVSCs的aSMA, SM22a, calponin和smoothelin的表達(dá)。(2)與培養(yǎng)于SCGM的對(duì)照組相比,培養(yǎng)于PDGF-BB的細(xì)胞,其基質(zhì)合成相關(guān)基因如collagen I, collagen III, elastin以及MMP2/9的表達(dá)上調(diào)。(3)與培養(yǎng)于SCGM的對(duì)照組相比,培養(yǎng)于RGM和PDGF-BB的細(xì)胞增殖能力更強(qiáng),與其平滑肌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)正相關(guān)。(4) SCGM培養(yǎng)的P3代MVSCs,分別在相應(yīng)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下,可分化為脂肪細(xì)胞,骨或軟骨細(xì)胞。3.內(nèi)源性活性氧(ROS)在MVSCs向合成型血管平滑肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用：(1)與分化的大鼠中動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(RASMCs)相比,MVSCs表達(dá)高水平的內(nèi)源性ROS,在分化為RASMCs過程中,內(nèi)源性ROS表達(dá)逐漸下降。(2)在PDGF誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)中,抗氧化基因Nrf2, NQO1,GCLC, GR以及SOD2表達(dá)顯著上調(diào)。以上基因在RGM培養(yǎng)的MVSCs中,其表達(dá)水平自P3代開始顯著上調(diào)并維持到P10代細(xì)胞。(3)在SCGM培養(yǎng)的P2代MVSCs,加入ROS清除劑Tiron和NAC后,細(xì)胞內(nèi)αSMA, SM22a, calponin和smoothelin表達(dá)顯著上調(diào)。而且,與未加入ROS清除劑的MVSCs相比,誘導(dǎo)的VSMCs增殖能力更強(qiáng)。4.脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Phospholipase A2, group 7, Pla2g7)通過生成ROS在MVSCs向合成型血管平滑肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用：(1)在PDGF誘導(dǎo)的MVSCs向VSMCs分化過程中,Pla2g7的mRNA表達(dá)下降。(2)抑制Pla2g7基因表達(dá)增強(qiáng)了MVSCs向VSMCs分化。結(jié)論：1.新分離的存活的大鼠胸主動(dòng)脈中膜的細(xì)胞是一類中膜多能血管干細(xì)胞(MVSCs),該細(xì)胞具有多能性,能快速分化為合成型血管平滑肌細(xì)胞。2.內(nèi)源性活性氧(ROS)對(duì)維持MVSCs的未分化狀態(tài)起關(guān)鍵作用,抑制內(nèi)源性ROS生成啟動(dòng)了MVSC向合成型VSMCs的分化。3. Pla2g7通過促進(jìn)內(nèi)源性ROS生成,在維持MVSCs的未分化狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。研究背景：目前研究證實(shí),在威脅人類健康的多種慢性代謝性疾病,如代謝綜合征,Ⅱ型糖尿病等,往往伴隨內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能障礙。血管內(nèi)膜的完整性是血管發(fā)揮功能的保障和前提條件,而在許多慢性代謝性疾病中,內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡對(duì)維持血管內(nèi)膜的完整性發(fā)揮關(guān)鍵作用。基于此,通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡修復(fù)損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞,從而修復(fù)損傷的血管內(nèi)膜,使其恢復(fù)完整性對(duì)許多代謝性疾病引起的血管病的轉(zhuǎn)歸具有重要意義。因此,尋找通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,減少凋亡的理想靶點(diǎn)對(duì)代謝性血管病的治療是目前研究的熱點(diǎn),但目前的進(jìn)展仍不理想。眾所周知,鍛煉對(duì)代謝性疾病和心血管疾病的預(yù)防和治療具有十分積極的作用。研究證明,Irisin是一種新發(fā)現(xiàn)的肌因子,是連接鍛煉和代謝平衡的橋梁。當(dāng)機(jī)體鍛煉時(shí),Irisin從骨骼肌中的釋放出來,可廣泛參與機(jī)體適度減肥,改善葡萄糖耐受不良等癥狀。最近的研究發(fā)現(xiàn),血液中Irisin水平在Ⅱ型糖尿病患者及慢性腎病患者中均降低。另有研究證實(shí),Irisin可作為肌肉來源的調(diào)節(jié)能量消耗的信號(hào),通過促進(jìn)棕色脂肪產(chǎn)熱從而在機(jī)體不同組織發(fā)揮功能。研究還發(fā)現(xiàn),持續(xù)鍛煉可促進(jìn)Irisin表達(dá),從而使BDNF基因表達(dá)顯著上升。另外,Irisin還可通過調(diào)節(jié)骨細(xì)胞分化在骨代謝中發(fā)揮作用。有趣的是,一項(xiàng)新的證據(jù)表明,Irisin可通過激活STAT3信號(hào)通路促進(jìn)小鼠H19-7 HN細(xì)胞增殖。該研究提示,除了能調(diào)節(jié)機(jī)體代謝平衡,Irisin還具有促增殖的作用。然而,Irisin對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚未見任何報(bào)道。研究目的：研究Irisin對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并闡明Irisin影響人內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制。研究方法：1.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。2.人重組Irisin蛋白表達(dá)與純化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。3.[3H]胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Irisin對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。4.細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢鋇Irisin對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。5.免疫熒光染色檢測(cè)Irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Ki67的表達(dá)。6. Western blot檢測(cè)Irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次,結(jié)果采用單因素方差分析或Holm's t檢驗(yàn)。P0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：1. Irisin促進(jìn)HUVEC的增殖：(1)[3H]胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,無血清條件下20 nM的irisin使HUVEC的[3H]胸腺嘧啶摻入率增加了約2.4倍。(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)法的結(jié)果顯示,20 nM和40 nM的irisin促進(jìn)了HUVEC的增殖。(3)Ki67免疫熒光染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,20 nM irisin顯著增加了表達(dá)Ki67細(xì)胞的數(shù)量。2. Irisin通過激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)HUVEC增殖：(1) Western blot結(jié)果顯示,Irisin處理后,HUVEC的磷酸化ERK的蛋白水平升高,而磷酸化p38 MAPK口AKT的蛋白水平未受影響。(2)ERK抑制劑U0126抑制Irisin誘導(dǎo)的ERK磷酸化后,Ki67免疫熒光染色和[3H]胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ERK抑制劑抑制了對(duì)irisin誘導(dǎo)的HUVEC的增殖。3. Irisin減少了高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,20 nM Irisin有效減少了高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。4. Irisin下調(diào)了Bax, Caspase-9和Caspase-3的表達(dá),上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示,20 nM irisin處理后,Bax, Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)下降,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高,GSK-3β與Bad表達(dá)未受影響。結(jié)論：1. Irisin促進(jìn)HUVEC增殖。2. Irisin通過激活ERK,而不是p38 MAPK和AKT信號(hào)通路,調(diào)節(jié)HUVEC增殖。3. Irisin抑制高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。4. Irisin通過上調(diào)Bcl-2,下調(diào)caspase的表達(dá),抑制高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。
[Abstract]:Vascular smooth muscle cells are more likely to be derived from vascular smooth muscle cells than mature smooth muscle cells .
The expression of Pla2g7 or NEDD8 gene in the cells was inhibited by RNAi . Real - time RT - PCR : Total RNA was extracted by TRIzol method under different conditions . Real - time RT - PCR was used to detect the mRNA expression level of the corresponding gene . The expression of the corresponding protein in the cells was determined by using flow cytometry . The results were as follows : 1 . The expression of the corresponding protein in the cell surface or cell was detected by using flow cytometry .
( 4 ) The results of immunofluorescence staining showed that NFM , SoS 10 and S100 尾 expressed stem cell markers NFM , SoS 10 and S100 尾 in all P1 cells cultured in SCGM and RGM . ( 2 ) Compared with the control group cultured in SCGM , the expression level of endogenous ROS , NQO1 , GCLC , GR and SOD2 in the cultured MVSCs were significantly up - regulated . ( 2 ) Inhibition of the expression of Pla2g7 gene enhances the differentiation of MVSCs into the vascular smooth muscle cells . Conclusion : 1 . The newly isolated viable rat thoracic aorta has a key role in promoting the differentiation of MVSCs into the synthetic vascular smooth muscle cells . It is found that Irisin plays an important role in the prevention and treatment of metabolic diseases , such as metabolic syndrome and type 鈪，

本文編號(hào)：2127637