發(fā)布時(shí)間：2018-04-25 16:23

  本文選題：神經(jīng)炎癥 + PI3K通路��； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：【研究背景和目的】原發(fā)性高血壓病是以血壓升高為主要特征的慢性疾病,根據(jù)《中國(guó)高血壓基層管理指南(2014年修訂版)》提供數(shù)據(jù)表明中國(guó)約有三分之一的成人患有高血壓疾病。因此,揭示高血壓病的發(fā)病機(jī)制對(duì)高血壓的防治尤為重要。有研究證實(shí)炎癥參與了神經(jīng)源性高血壓的發(fā)生發(fā)展。血壓正常的大鼠通過(guò)腹腔注射低脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)全身性輕度炎癥可以顯著升高血壓,但在RAG-1-/-導(dǎo)致T細(xì)胞和B細(xì)胞缺乏無(wú)法產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)的小鼠中,可以顯著改善由血管緊張素II(Angiotensin II,Ang II)或醋酸去氧皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的高血壓和血管功能異常。有研究報(bào)道在高血壓患者和動(dòng)物外周循環(huán)系統(tǒng)中存在輕度炎癥反應(yīng),以上證據(jù)提示炎癥參與了原發(fā)性高血壓病的發(fā)生發(fā)展。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也存在免疫炎癥反應(yīng),稱之為神經(jīng)炎癥(neuroinflammation),主要以小膠質(zhì)細(xì)胞激活導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生增加為特征。有研究報(bào)道正常血壓大鼠心血管調(diào)節(jié)核團(tuán)下丘腦室旁核(Paraventricular nucleus,PVN)微量注射促炎細(xì)胞因子白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)或腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)可以引起血壓和大鼠腎交感神經(jīng)活動(dòng)(Renal sympathetic nerve activity,RSNA)增加。另外,激活腦小膠質(zhì)細(xì)胞可以延長(zhǎng)腦室內(nèi)注射Ang II引起的升壓效應(yīng)。延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是交感神經(jīng)調(diào)控的關(guān)鍵中樞,在維持基礎(chǔ)血壓保持交感神經(jīng)緊張性中具有重要作用。腹腔注射LPS誘導(dǎo)的全身炎癥可導(dǎo)致RVLM內(nèi)神經(jīng)炎癥產(chǎn)生,從而參與了血壓升高和交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)等病理改變。因此,探究神經(jīng)炎癥在高血壓心血管功能中樞調(diào)節(jié)中的作用和意義尤為重要,并為尋找高血壓防治的新策略提供新的思路。腎素血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)過(guò)度激活在高血壓的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。在離體培養(yǎng)細(xì)胞和在體模型中,Ang II可以激活靜止的小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。最近的證據(jù)表明Ang II的1型受體(Angiotensin II type 1 receptor,AT1R)阻斷劑-坎地沙坦阻斷AT1R可以減弱LPS誘導(dǎo)的中樞炎癥反應(yīng)。因此,上述研究提示Ang II誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥參與了高血壓交感輸出增強(qiáng)機(jī)制。已有研究證實(shí)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在拮抗過(guò)度激活的RAS中發(fā)揮著重要的補(bǔ)償機(jī)制,ACE2將Ang II和血管緊張素I(angiotensini,angi)轉(zhuǎn)化成血管緊張素-1-7[angiotensin-1-7,ang-(1-7)],而ang-(1-7)通過(guò)與mas受體相結(jié)合發(fā)揮與angii相拮抗的生物學(xué)效應(yīng)。ace2/ang-(1-7)/masr軸主要通過(guò)增加一氧化氮的合成減少ros生成發(fā)揮其心血管保護(hù)效應(yīng)(如舒張血管、抗肥厚性心肌病等)。在心血管神經(jīng)調(diào)節(jié)區(qū)域特異性過(guò)表達(dá)ace2能降低高血壓大鼠血壓水平和交感神經(jīng)活動(dòng),并改善慢性心衰大鼠的壓力反射功能。有趣的是,有研究報(bào)道ang-(1-7)對(duì)離體培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮抗炎效應(yīng)。證據(jù)表明心血管調(diào)節(jié)中樞rvlm內(nèi)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3kinase,pi3k)通路參與了血壓和中樞交感輸出的調(diào)節(jié)。在高血壓大鼠rvlm中pi3k通路明顯上調(diào),其失活導(dǎo)致rvlm內(nèi)活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ros)產(chǎn)生減少,改善高血壓心血管功能。而本課題組之前發(fā)現(xiàn)在rvlm干擾pi3k-p110δ亞基的表達(dá)導(dǎo)致中樞抗高血壓效應(yīng),而且pi3k通路也被證實(shí)參與了損傷和感染引起的外周的一些炎癥反應(yīng)。因此,本研究的主要研究目標(biāo)是明確rvlm內(nèi)pi3k通路在高血壓神經(jīng)炎癥中發(fā)揮的作用,并探索異常的ras對(duì)高血壓神經(jīng)炎癥的影響是否與pi3k通路有關(guān)。根據(jù)上述背景,本研究主要為了明確:1)在高血壓大鼠rvlm中干擾pi3k基因表達(dá)能否抑制神經(jīng)炎癥;2)在血壓正常的wky大鼠提前干擾rvlm內(nèi)pi3k通路能否減弱angii誘導(dǎo)的血壓升高和rvlm神經(jīng)炎癥;3)pi3k通路是否參與過(guò)表達(dá)ace2減弱高血壓大鼠rvlm神經(jīng)炎癥發(fā)揮抗高血壓效應(yīng)�！狙芯糠椒ā繉�(shí)驗(yàn)中所用的動(dòng)物為體重280-320g的雄性wky大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneouslyhypertensiverat,shr)。wky大鼠通過(guò)第四腦室灌注lps或angii來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥。通過(guò)elisa和免疫熒光分別檢測(cè)各組大鼠rvlm內(nèi)促炎細(xì)胞因子水平和小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況,westernblot檢測(cè)各組大鼠rvlm內(nèi)pi3k-p110δ亞基的表達(dá)以及akt的磷酸化水平。通過(guò)rvlm內(nèi)注射相關(guān)慢病毒來(lái)特異性干擾rvlm內(nèi)pi3k-p110δ亞基表達(dá)和過(guò)表達(dá)ace2,最后在shr進(jìn)行驗(yàn)證�！窘Y(jié)果】一、干擾rvlm內(nèi)pi3k信號(hào)通路減弱高血壓rvlm內(nèi)神經(jīng)炎癥。wky大鼠rvlm內(nèi)注射攜帶有g(shù)fp基因慢病毒15天后通過(guò)熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)rvlm內(nèi)局限地表達(dá)gfp綠色熒光。為了驗(yàn)證攜帶有pi3k-p110δ-shrna的慢病毒的干擾效率,感染病毒后,大鼠rvlm內(nèi)pi3k-p110δ亞基的表達(dá)顯著降低,并觀察到shr相比于wky大鼠rvlm內(nèi)pi3k-p110δ亞基的表達(dá)顯著增加。另外,相比于wky大鼠,shr-rvlm內(nèi)促炎細(xì)胞因子含量(il-1β:55.9±18.2vs.141.8±7.54pg/mg,p0.05;il-6:309±18.2vs.598±26.0pg/mg,p0.05;tnf-α:56.3±3.76vs.98.0±15.4pg/mg,p0.05),麻醉狀態(tài)下血壓(125±2.50vs.183±8.05mmhg),心率(363±10.6vs.441±11.4bpm)和基礎(chǔ)rsna(11.3±0.514vs.38.0±2.03%max)也顯著增加。重要的是,shr提前干擾rvlm內(nèi)pi3k-p110δ亞基可以顯著減少rvlm內(nèi)il-1β、il-6和tnf-α的含量水平,以及改善麻醉狀態(tài)下和清醒狀態(tài)下心血管功能。而在wky大鼠中,rvlm內(nèi)干擾pi3k-p110δ亞基的表達(dá)對(duì)其血壓和心率沒有影響。二、干擾rvlm內(nèi)pi3k信號(hào)通路減弱angii誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和心血管功能異常。第四腦室灌注angii可以顯著增加wky大鼠rvlm內(nèi)pi3k-p110δ亞基的表達(dá)和akt的473位絲氨酸磷酸化水平。為進(jìn)一步明確pi3k對(duì)angii誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的影響,在wky大鼠第四腦室灌注angii之前在rvlm內(nèi)注射攜帶有pi3k-p110δ-shrna基因的慢病毒。wky大鼠第四腦室灌注angii一周后,心血管功能顯著增加(map:148±1.89vs.116±2.75mmhg;hr:430±10.6vs.367±14.6bpm;基礎(chǔ)rsna:24.6±2.72vs.10.2±1.00%max),并且rvlm內(nèi)促炎細(xì)胞因子水平也顯著增加(il-1β:188±17.7vs.126±3.76pg/mg;il-6:686±35.5vs.544±5.39pg/mg;tnf-α:94.5±5.94vs.66.0±3.55pg/mg),相比于第四腦室灌注acsf的wky大鼠。有趣的是,第四腦室灌注angii誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子和心血管功能的增加可以被rvlm內(nèi)預(yù)先干擾pi3k-p110δ亞基表達(dá)所減弱。三、過(guò)表達(dá)ace2抑制pi3k信號(hào)通路減弱高血壓大鼠rvlm內(nèi)神經(jīng)炎癥。RVLM內(nèi)注射攜帶有ACE2基因的慢病毒過(guò)表達(dá)ACE2的效率通過(guò)RVLM內(nèi)ACE2蛋白表達(dá)水平和Ang-(1-7)/Ang II比值顯著增加來(lái)確定。相比于第四腦室灌注aCSF的WKY大鼠,通過(guò)第四腦室灌注LPS2周的WKY大鼠可以顯著增加血壓、心率和基礎(chǔ)RSNA。第四腦室灌注LPS顯著增加RVLM內(nèi)促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平;此外,也顯著上調(diào)RVLM內(nèi)PI3K-p110δ亞基的表達(dá)以及增加AKT473位絲氨酸的磷酸化水平,這些改變均能被RVLM內(nèi)預(yù)先過(guò)表達(dá)ACE2基因所阻斷。在SHR中,RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)ACE2四周后可以顯著降低血壓、心率和基礎(chǔ)RSNA。相比于WKY大鼠,SHR-RVLM促炎細(xì)胞因子水平顯著增加(IL-1β:92.9±13.3 vs.136±9.62 pg/mg,P0.05;IL-6:428±83.8 vs.582±51.5 pg/mg,P0.05;TNF-α:40.6±4.0 vs.65.4±11.1 pg/mg,P0.05),這些增加的促炎細(xì)胞因子可以被過(guò)表達(dá)ACE2所降低。而且過(guò)表達(dá)ACE2也可以顯著減少PI3K-p110δ亞基的表達(dá)以及AKT磷酸化水平。然而,WKY大鼠RVLM過(guò)表達(dá)ACE2可以對(duì)血壓和PI3K信號(hào)并無(wú)影響�！窘Y(jié)論】RVLM內(nèi)PI3K/AKT通路激活介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥導(dǎo)致高血壓心血管功能異常,RVLM內(nèi)干擾PI3K通路能抑制Ang II誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥和心血管功能異常,而RVLM特異性過(guò)表達(dá)ACE2通過(guò)抑制PI3K/AKT通路活性減弱高血壓RVLM神經(jīng)炎癥水平。本研究明確了PI3K通路介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥參與高血壓交感亢進(jìn),為高血壓交感亢進(jìn)的機(jī)制研究和防治策略提供了新思路。
[Abstract]:In this study , it is important to study the role and significance of peripheral blood pressure in the pathogenesis of hypertension . These findings suggest that Ang II - induced neuroinflammation plays an important role in the pathogenesis of hypertension sympathetic output . It has been shown that angiotensin - converting enzyme 2 ( ACE2 ) plays an important compensatory mechanism in the antagonism of hyperactivated RAS . ACE2 converts Ang II and angiotensin I ( 1 - 7 ) into angiotensin - 1 - 7 renin angiotensin - 1 - 7 , ang - ( 1 - 7 ) , and ang - ( 1 - 7 ) plays a biological effect against angii by combining with the mas receptor . ace2 / ang - ( 1 - 7 ) / masr - axis exerts its cardioprotective effect ( e.g . , vasodilators , hypertrophic cardiomyopathy , etc . ) by increasing the synthesis of nitric oxide . In this study , it was found that the expression of rvlm in rvlm interferes with the effects of rvlm in the pathogenesis of hypertension . In contrast to wky rats , the rvlm internal pik - p110未 subunit could significantly decrease the expression of the pik - p110未 subunit in the rvlm rats and improve the cardiovascular function in the conscious state . Compared with WKY rats , the level of pro - inflammatory cytokines in RVLM increased significantly ( IL - 1尾 : 92.9 鹵 13.3 vs . 136 鹵 9.62 pg / mg , P0.05 ; IL - 6 : 428 鹵 83.8 vs . 582 鹵 51.5 pg / mg , P0.05 ; TNF - 偽 : 40.6 鹵 4.0 vs . 65.4 鹵 11.1 pg / mg , P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R544.1

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號(hào)：1802086