本文選題：腺苷 + 腺苷A2a受體��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：近幾年,心血管疾病的發(fā)病率以及死亡率逐年升高,每年有大量的病人需要進(jìn)行旁路血管移植手術(shù),因此臨床上對(duì)于直徑小于6 mm的組織工程血管需求量很高。但是小口徑組織工程血管常常由于血栓形成以及內(nèi)膜增生而導(dǎo)致移植手術(shù)的失敗。大量的研究表明內(nèi)皮細(xì)胞具有抗血栓、抑制平滑肌細(xì)胞的病理性增殖和血小板的集聚的功能,因此組織工程血管的早期快速內(nèi)皮化是維持移植的小口徑組織工程血管通暢一個(gè)十分重要的因素。內(nèi)皮祖細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,在缺血或者血管受損的情況下,可以從骨髓動(dòng)員并歸巢到相應(yīng)部位,促進(jìn)血管內(nèi)皮的修復(fù)或者毛細(xì)血管生成�？茖W(xué)家通過表征內(nèi)皮祖細(xì)胞的特異性抗體如CD34或者CD133等在體捕獲循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞,促進(jìn)組織工程血管的快速內(nèi)皮化,在移植的早期取得了較好的通暢效果,然而在移植后一個(gè)月時(shí)卻出現(xiàn)了不同程度的內(nèi)膜增生。究其原因,主要由于是組織工程血管局部的微環(huán)境不適合歸巢干細(xì)胞的生存和功能發(fā)揮,卻可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的病理性增殖。同時(shí)需要進(jìn)行血管旁路移植的患者多伴隨有糖尿病等基礎(chǔ)性疾病,高糖以及高糖引起的高氧化應(yīng)激使得組織工程血管局部的微環(huán)境更加惡劣,更不利于歸巢干細(xì)胞促血管生成功能的發(fā)揮。因此除了促進(jìn)早期快速內(nèi)皮化,優(yōu)化移植后的局部微環(huán)境對(duì)于維持組織工程血管的長(zhǎng)期通暢以及構(gòu)建抗高糖損傷的組織工程血管具有十分重要的意義。腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷,在缺血、缺氧或者炎癥等惡劣的環(huán)境下,局部組織中腺苷的濃度會(huì)相應(yīng)升高,調(diào)節(jié)局部組織和細(xì)胞的能量代謝,保護(hù)其免受外界因素的損傷,促進(jìn)血管生成和毛細(xì)血管密度的增加,也被稱為retaliatory metabolite。在細(xì)胞表面表達(dá)有腺苷的四個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體,腺苷受體的激活具有誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢和調(diào)控炎癥反應(yīng)等生物學(xué)功能。組織工程血管移植后的微環(huán)境是一個(gè)缺血、缺氧和炎癥增加的微環(huán)境,腺苷可能通過優(yōu)化局部微環(huán)境來促進(jìn)組織工程血管的早期快速內(nèi)皮化和維持移植后的長(zhǎng)期通暢。因此,我們以腺苷及其受體為研究工具,從五個(gè)方面深入研究局部微環(huán)境的優(yōu)化對(duì)組織工程血管長(zhǎng)期通暢的影響。一、腺苷通過調(diào)控細(xì)胞能量代謝優(yōu)化組織工程血管微環(huán)境骨髓造血干細(xì)胞在生理狀態(tài)下處于靜息和未分化狀態(tài),保證骨髓和外周血循環(huán)中血細(xì)胞數(shù)量平衡的穩(wěn)定。mondal等的研究發(fā)現(xiàn)這種靜息狀態(tài)的維持是通過腺苷酸脫氨酶生長(zhǎng)因子a(adgf-a)將腺苷的濃度降低到極低的水平來介導(dǎo)的。我們的研究第一次證明了腺苷可以通過能量轉(zhuǎn)換促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢,實(shí)現(xiàn)組織工程血管的早期快速內(nèi)皮化。歸巢的內(nèi)皮祖細(xì)胞在腺苷的作用下,可以分泌vegf、sdf-1和mmp-9等血管生成因子,進(jìn)一步促進(jìn)周圍內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。此外,腺苷還可以通過細(xì)胞保護(hù)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和抑制平滑肌增殖等機(jī)制優(yōu)化組織工程血管移植后的局部微環(huán)境,最終促進(jìn)血管移植物的長(zhǎng)期通暢。為了解決腺苷在循環(huán)系統(tǒng)中半衰期極短的問題,我們制作了負(fù)載有腺苷的β-環(huán)糊精/殼聚糖納米緩釋顆粒,并通過層層組裝的方式構(gòu)建了腺苷修飾的組織工程血管。組織工程血管內(nèi)表面涂層的腺苷分子能夠快速的被釋放,促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢,實(shí)現(xiàn)工程血管的快速內(nèi)皮化,而負(fù)載有腺苷的β-環(huán)糊精/殼聚糖納米緩釋顆粒會(huì)緩慢地在局部釋放腺苷,長(zhǎng)時(shí)程優(yōu)化移植的組織工程血管局部微環(huán)境,維持血管的持續(xù)通暢。二、腺苷受體調(diào)控單核/巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞之間的crosstalk腺苷發(fā)揮生物學(xué)功能主要通過兩個(gè)途徑:直接進(jìn)入細(xì)胞作為atp生成的底物參與細(xì)胞能量代謝;與細(xì)胞表面的腺苷受體相結(jié)合,激活其下游的信號(hào)通路。然而腺苷受體激活是否可以參與組織工程血管微環(huán)境的優(yōu)化和長(zhǎng)期通暢的維持目前還不清楚。組織工程血管的支架材料多為同種的脫細(xì)胞基質(zhì)或者plga等多聚物,這些物質(zhì)移植進(jìn)入體內(nèi)后,不可避免的會(huì)引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是引起血栓形成和內(nèi)膜增生的最重要的機(jī)制之一,而breuer等研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)可以介導(dǎo)組織工程血管重構(gòu)形成一個(gè)成熟的血管。因此適度調(diào)控移植后的炎癥反應(yīng)可能會(huì)成為維持組織工程血管通暢的一個(gè)有效的途徑。腺苷a2a受體在單核/巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞表面均高表達(dá),且具有促血管生成和炎癥調(diào)控等功能,因此我們將腺苷a2a受體作為一個(gè)工具,研究腺苷受體激活對(duì)組織工程血管通暢的影響。我們首先制備了羥丙級(jí)-β-環(huán)糊精/殼聚糖納米顆粒來控制腺苷a2a受體激動(dòng)劑cgs21680釋放和增加其水溶性,并采用層層組裝的方式構(gòu)建cgs21680修飾的組織工程血管,其可以控制藥物在一個(gè)月內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定釋放。移植6個(gè)月后,cgs21680修飾的組織工程血管仍維持通暢,內(nèi)皮化良好。我們進(jìn)一步檢測(cè)移植后不同時(shí)間段組織工程血管內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞核型的轉(zhuǎn)換,結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后第3天相對(duì)于cgs21680組,對(duì)照組移植后m1型單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著升高,并隨著時(shí)間的累積進(jìn)一步提升;而對(duì)照組m2型單核/巨噬細(xì)胞的數(shù)量要明顯的低于cgs21680組。體外的結(jié)果顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞在炎性刺激下顯著表達(dá)e-selectin,促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞核型向m1型的極化。腺苷a2a受體激活直接通過cox-2通路促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞向m2型的極化和分泌更多的vegf、il-10等促血管生成因子,誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移和動(dòng)員;同時(shí)還可以通過降低內(nèi)皮祖細(xì)胞表面促炎分子icam-1、vcam-1和e-selectin的表達(dá),抑制單核/巨噬細(xì)胞向m1型的極化。綜上,我們的研究第一次證明了歸巢的內(nèi)皮祖細(xì)胞在炎癥刺激下,可以促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞向m1型極化,加劇組織工程血管局部的炎癥反應(yīng);腺苷a2a受體的激活可以通過調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞之間的crosstalk,誘導(dǎo)移植產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)向促進(jìn)血管化的趨勢(shì)發(fā)展,最終促進(jìn)組織工程血管的通暢。三、內(nèi)源性腺苷維持組織工程血管長(zhǎng)期通暢的作用研究上述的研究表明外源性給予腺苷或者選擇性激活腺苷受體可以通過優(yōu)化局部微環(huán)境促進(jìn)組織工程血管的長(zhǎng)期通暢,然而腺苷在體半衰期過短使得外源性給藥劑量的控制和維持長(zhǎng)期平穩(wěn)的釋放十分困難,因此研究?jī)?nèi)源性腺苷對(duì)組織工程血管長(zhǎng)期通暢的影響能為構(gòu)建內(nèi)源性腺苷持續(xù)穩(wěn)定釋放的組織工程血管提供理論基礎(chǔ)�？紫堵屎涂讖酱笮∨c組織工程材料內(nèi)的細(xì)胞的存活、增殖和分化緊密相關(guān)。大的孔徑和相互連通的網(wǎng)絡(luò)有利于材料內(nèi)細(xì)胞與外界進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和氧氣的交換,有文獻(xiàn)報(bào)道維持材料內(nèi)部血管與外界進(jìn)行充足的氧氣和物質(zhì)交換的最小孔徑大約為30到40um。然而較大的孔隙率和孔徑降低了生物材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。組織工程血管移植后需要經(jīng)受血液很大的流體剪切力和沖刷力,不穩(wěn)定的材料結(jié)構(gòu)容易引起組織工程血管堵塞、變形甚至破裂。有人認(rèn)為組織工程血管內(nèi)層的孔徑應(yīng)該小于24um,這低于維持物質(zhì)交換所需的最小孔徑。因此組織工程血管局部的微環(huán)境在外層毛細(xì)血管長(zhǎng)入前是一個(gè)嚴(yán)重缺氧和營(yíng)養(yǎng)匱乏的微環(huán)境,不利于浸潤(rùn)的單核/巨噬細(xì)胞的生存。磷酸鹽濃度的升高與心血管疾病的發(fā)生緊密相關(guān),此外磷酸鹽濃度的升高還可以提高細(xì)胞的能量代謝,增加atp的生成,這進(jìn)一步加重了移植材料內(nèi)部缺血缺氧環(huán)境下細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān),加劇了細(xì)胞的損傷和死亡。klotho蛋白是一種抗細(xì)胞衰老蛋白,與鈣磷代謝和能量代謝均緊密相關(guān),這提示了klotho蛋白可能具有促進(jìn)內(nèi)源性腺苷釋放來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)的功能。我們的結(jié)果顯示klotho蛋白能改變生物材料內(nèi)浸潤(rùn)的單核/巨噬細(xì)胞對(duì)胞外高磷的應(yīng)答模式,降低能量代謝水平,維持細(xì)胞的存活和降低細(xì)胞凋亡。同時(shí)能量代謝的降低使細(xì)胞內(nèi)atp大量降解,釋放大量的內(nèi)源性腺苷。流式檢測(cè)的結(jié)果顯示外周血增多的腺苷可以打破骨髓中干細(xì)胞的靜息狀態(tài),提高其能量代謝水平,促進(jìn)更多的內(nèi)皮祖細(xì)胞向外周血?jiǎng)訂T和向單核/巨噬細(xì)胞遷移。鐵絲損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明klotho蛋白可以促進(jìn)血液中增多的內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢到損傷的部位,通過分化形成內(nèi)皮細(xì)胞和旁分泌作用促進(jìn)組織工程血管的快速內(nèi)皮化。因此我們采用β-環(huán)糊精/殼聚糖納米顆粒和層層組裝的方式構(gòu)建了klotho蛋白修飾的組織工程血管,這種血管可以控制klotho蛋白穩(wěn)定釋放超過一個(gè)月。移植六個(gè)月后,klotho蛋白修飾的組織工程血管的通暢率達(dá)到了90%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)的高于對(duì)照組。染色和掃描電鏡的結(jié)果顯示其內(nèi)皮化程度良好,無明顯的內(nèi)膜增生和血栓形成。綜上,我們的結(jié)果證明了klotho蛋白具有將無機(jī)磷增加的信號(hào)通過調(diào)控能量代謝的方式最終轉(zhuǎn)換為內(nèi)源性腺苷的功能,內(nèi)源性腺苷釋放的增加可以通過促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員和優(yōu)化局部微環(huán)境維持組織工程血管的長(zhǎng)期通暢。四、腺苷在糖尿病疾病狀態(tài)下保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞的機(jī)制研究需要進(jìn)行血管旁路移植的患者多伴隨有糖尿病等基礎(chǔ)性疾病,高糖以及高糖引起的高氧化應(yīng)激加劇了組織工程血管移植后局部微環(huán)境的惡化和干細(xì)胞損傷,使得糖尿病疾病狀態(tài)下組織工程血管移植成功的難度進(jìn)一步增加,目前還沒有組織工程血管在糖尿病狀態(tài)下構(gòu)建成功的報(bào)道。因此研究糖尿病條件下微環(huán)境優(yōu)化和干細(xì)胞保護(hù)對(duì)于構(gòu)建抗高糖損傷的組織工程血管具有十分重要的意義。自噬是機(jī)體內(nèi)一個(gè)重要的生理現(xiàn)象,可以將代謝廢物轉(zhuǎn)化為氨基酸等細(xì)胞進(jìn)行三羧酸循環(huán)所必須的原料,加速細(xì)胞代謝廢物清除。我們的研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者體內(nèi),內(nèi)皮祖細(xì)胞的自噬水平顯著下降,而能量代謝的水平則顯著升高,自噬與能量代謝穩(wěn)態(tài)失衡最終引起內(nèi)皮祖細(xì)胞促血管生成功能受損,甚至死亡。腺苷通過增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的自噬水平,維持自噬與能量代謝穩(wěn)態(tài)的平衡,保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞免受高糖的損傷和促進(jìn)其向內(nèi)皮細(xì)胞分化。為了在體驗(yàn)證腺苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)作用,我們選擇了糖尿病潰瘍作為動(dòng)物驗(yàn)證模型。內(nèi)皮祖細(xì)胞在受腺苷刺激后種植到提前制備好的可降解生物材料上,培養(yǎng)48小時(shí)后移植到糖尿病潰瘍的表面。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺苷顯著增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞-生物材料對(duì)糖尿病潰瘍愈合的治療作用,其機(jī)制是腺苷通過自噬保護(hù)移植內(nèi)皮祖細(xì)胞促血管生成功能和促進(jìn)其分化。綜上我們的研究發(fā)現(xiàn)腺苷可以作為抗高糖損傷組織工程血管的一個(gè)構(gòu)建靶點(diǎn),來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和促血管生成的功能。五、抗高糖損傷組織工程血管的構(gòu)建腺苷具有內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員歸巢、干細(xì)胞保護(hù)和微環(huán)境優(yōu)化等生物學(xué)功能,然而將其直接應(yīng)用于糖尿病的血管替代治療效果卻很不理想,目前還未見可用于糖尿病血管替代的組織工程血管的成功報(bào)道。究其原因,主要是由于糖尿病外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、旁分泌和分化等促血管生成的功能受到了嚴(yán)重的損害,歸巢到組織工程血管內(nèi)表面不能促進(jìn)血管的快速內(nèi)皮化;同時(shí)糖尿病體內(nèi)高糖和氧化應(yīng)激的微環(huán)境加劇了組織工程血管移植后的炎癥反應(yīng),進(jìn)而對(duì)歸巢的干細(xì)胞造成了進(jìn)一步的損傷。適合糖尿病的組織工程血管理想涂層藥物至少需要同時(shí)具備干細(xì)胞捕獲、恢復(fù)受損的干細(xì)胞功能、抵御高糖損傷和優(yōu)化局部微環(huán)境四個(gè)功能。腺苷激酶(ADK)是一種催化腺苷生成ATP的核苷激酶,研究表明腺苷激酶表達(dá)上調(diào)會(huì)加速缺血條件下細(xì)胞的損傷和死亡,而腺苷激酶抑制有助于維持組織損傷狀態(tài)下細(xì)胞能量代謝的維持,抵御疾病的損傷。同時(shí)腺苷激酶抑制的細(xì)胞可以持續(xù)的釋放腺苷,腺苷是一種局部微環(huán)境的優(yōu)化分子,具有調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞保護(hù)和促進(jìn)血管生成等作用。這些都說明了腺苷激酶可以作為糖尿病狀態(tài)下干細(xì)胞基因調(diào)控作用靶點(diǎn)的可能性。因此,我們構(gòu)建了CD133/ADK嵌合體修飾的組織工程血管血管,其在糖尿病大鼠體內(nèi)移植30天后依舊維持通暢,沒有顯著的內(nèi)膜增生和血栓形成。我們的組織工程血管由組織工程血管支架和CD133/ADK嵌合體兩個(gè)部分構(gòu)成,移植前兩個(gè)部分混合可以自組裝形成穩(wěn)定的RNA修飾的組織工程血管。我們準(zhǔn)備了聚醚酰亞胺(PEI)/金納米顆粒,顆粒大小約為200nm。制備過程中四氯合金酸(HAu Cl4)的升高,降低了PEI/金納米顆粒的轉(zhuǎn)染能力,進(jìn)而來減少RNA轉(zhuǎn)染的非特異性;同時(shí)還增加組織工程血管的穩(wěn)定性和生物相容性,更能抵抗循環(huán)系統(tǒng)的剪切和沖刷。CD133/ADK嵌合體由CD133適配體RNA和ADK SiRNA構(gòu)成,CD133適配體特異性的捕獲循環(huán)中的CD133陽性細(xì)胞。捕獲的細(xì)胞能內(nèi)吞結(jié)合的嵌合體,在細(xì)胞內(nèi)Dicer酶的特異性剪切下形成ADK SiRNA,改善CD133陽性細(xì)胞受損的促血管生成功能,保護(hù)細(xì)胞免受高糖的損傷。同時(shí)轉(zhuǎn)染的ADK SiRNA使得細(xì)胞成為了一個(gè)持續(xù)釋放腺苷的生物反應(yīng)器,腺苷具有顯著的內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員和微環(huán)境優(yōu)化的作用�？傊�,我們成功構(gòu)建了第一條RNA修飾的組織工程血管和第一條在糖尿病疾病狀態(tài)下保持通暢的組織工程血管;CD133/ADK嵌合體通過特異性捕獲、細(xì)胞保護(hù)和促進(jìn)靶細(xì)胞持續(xù)釋放腺苷促進(jìn)組織工程血管在糖尿病狀態(tài)下的快速內(nèi)皮化和長(zhǎng)期的通暢。我們的研究為疾病狀態(tài)下組織工程血管的構(gòu)建提供了新的思路。.
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R54
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本文編號(hào)：1798406