本文選題：dCK + 自噬��； 參考：《吉林大學》2017年博士論文

【摘要】：細胞死亡是一種基本生物過程,對維持組織機能和形態(tài)具有重要作用。細胞死亡的執(zhí)行需要一些重要程序的相互配合,包括:凋亡、自噬、壞死和有絲分裂災難等。細胞凋亡,指直接導致細胞死亡的特征性改變。在過去的幾十年里,細胞凋亡被廣泛研究,針對細胞凋亡的放射治療策略成為腫瘤治療的重要手段之一。自噬是一種溶酶體依賴的自我吞噬過程,可維持細胞穩(wěn)態(tài)并為底物提供能量。自噬在營養(yǎng)缺乏、ROS、乏氧、DNA損傷等應(yīng)激條件下能夠促進細胞存活。然而,當細胞損傷超出一定生理條件下修復的限度時,自噬就引起程序性細胞死亡,即自噬性死亡。除凋亡和自噬以外,有絲分裂災難可作為一種非典型的細胞死亡方式防止DNA損傷應(yīng)答中有絲分裂的干擾和基因組不穩(wěn)定性,從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。當細胞進入有絲分裂期,經(jīng)過短暫的細胞周期停滯后細胞并未分離,可導致有絲分裂災難的發(fā)生。脫氧胞苷激酶(Deoxycytidine kinase,d CK)是脫氧核苷酸生物合成補救途徑中的關(guān)鍵酶,能夠維持正常DNA代謝并磷酸化多種抗病毒和抗癌的核苷類似物藥物,這些藥物只有在磷酸化后才能被活化,從而抑制腫瘤生長。我們前期研究發(fā)現(xiàn),d CK能夠使內(nèi)源性脫氧核苷酸磷酸化,并參與DNA損傷修復過程。d CK蛋白有四個磷酸化位點:Thr-3,Ser-11,Ser-15和Ser-74。Ser-74位點磷酸化可激活d CK,而Thr-3對促進d CK的穩(wěn)定性具有重要作用。在電離輻射(IR)作用下,共濟失調(diào)毛細血管擴張突變蛋白(The protein kinase ataxia-telangiectasia mutated,ATM)能夠磷酸化d CK Ser-74位點并激活d CK,促進d CK與周期蛋白依賴性激酶1(Cyclin-dependent kinases,Cdk1)相互作用來調(diào)節(jié)G2/M期檢查點。此外,ATM能夠抑制Akt/m TOR/P70S6K通路促進IR誘導的自噬,但迄今為止,IR作用下d CK與細胞死亡的關(guān)系及其作用機制尚未見報道。目的:本文旨在研究d CK在IR誘導細胞死亡的過程中的作用及其可能作用機制,為腫瘤的基因靶向治療提供新依據(jù)。方法:(1)選用人宮頸癌細胞株He La,人乳腺癌細胞株SKBR3和MDA-MB-231為研究對象;(2)通過基因工程技術(shù)構(gòu)建d CK沉默及d CK過表達細胞模型;(3)通過3-MA,Rapamycin,ZVAD-FMK,Necrostatin-1,Ferrostatin-1區(qū)分不同類型的細胞死亡;(4)CCK-8和集落形成檢測細胞存活和輻射敏感性;(5)Western blot檢測蛋白水平;(6)免疫共沉淀技術(shù)(Co-immunoprecipitation)檢測蛋白與蛋白之間的結(jié)合情況;(7)流式細胞術(shù)檢測細胞總死亡率、凋亡、自噬、細胞周期、多倍體及有絲分裂細胞;(8)深部X射線治療機照射細胞,照射條件:電流18.0m A,電壓180k V,濾板0.25mm Cu和1.0mm Al,劑量率0.40 Gy·min-1,靶皮距60cm。結(jié)果:1.沉默d CK增加IR誘導的細胞死亡沉默d CK的He La細胞分別給予不同劑量IR處理,集落形成結(jié)果顯示,與空載體(p SUPER)相比,沉默d CK后,隨著照射劑量的增加,細胞的克隆形成率明顯減少,D0值分別為2.35(p SUPER),2.01(d CKRi),提示沉默d CK增加He La細胞的輻射敏感性。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p SUPER、d CKRi載體的SKBR3,MDA-MB-231細胞給予8Gy照射(IR),流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),IR誘導MDA-MB-231細胞死亡率明顯高于SKBR3細胞。經(jīng)過IR處理,SKBR3-p SUPER,SKBR3-d CKRi細胞死亡率分別增加了141%,169%;MDA-MB-231-p SUPER,MDA-MB-231-d CKRi細胞死亡率增加了302%,355%,提示沉默d CK增加IR誘導的乳腺癌細胞死亡,并且MDA-MB-231細胞比SKBR3細胞輻射敏感性強。2.d CK Ser-74位點的磷酸化抑制IR誘導的細胞死亡將沉默d CK的細胞分別轉(zhuǎn)染Vector,d CK-WT(野生型d CK),d CK-S74A(Ser-74位點突變成丙氨酸,屬于低磷酸化型d CK),d CK-S74E(Ser-74位點突變成谷氨酸,屬于過磷酸化型d CK),8Gy照射后沉默d CK的He La細胞生存率減少至60.79%,而過表達d CK可明顯逆轉(zhuǎn)IR誘導的細胞死亡,生存率由高到低分別為d CK-S74E(93.58%)d CK-WT(81.93%)d CK-S74A(69.93%)。沉默d CK的SKBR3與MDA-MB-231細胞經(jīng)過8Gy照射處理,細胞死亡率分別增加了129%,366%。而過表達d CK可明顯降低IR誘導的細胞死亡,在SKBR3的細胞模型中,細胞死亡率增加幅度由高到低分別為d CK-S74A(137%)d CK-WT(90%)d CK-S74E(65%);在MDA-MB-231的細胞模型中,細胞死亡率增加幅度由高到低分別為d CK-S74A(357%)d CK-WT(320%)d CK-S74E(195%)。以上結(jié)果提示,d CK Ser74位點的磷酸化可增加細胞的輻射抗性。3.d CK參與IR誘導多種細胞死亡將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p SUPER、d CKRi載體的He La細胞分別給予3-MA,Rapamycin,ZVAD-FMK,Necrostatin-1,Ferrostatin-1,加藥1h后經(jīng)過8Gy照射,與control組相比,3-MA明顯增加了IR誘導的細胞死亡,其中p SUPER細胞死亡率增加了29%,d CKRi細胞死亡率增加了25%。Rapamycin和ZVAD-FMK明顯降低了IR誘導的細胞死亡。但Ferrostatin-1和Necrostatin對IR誘導的細胞死亡無顯著影響。在SKBR3細胞模型中,3-MA對IR誘導的細胞死亡無明顯改變,而Rapamycin能夠明顯增加IR誘導的細胞死亡,其中p SUPER增加了42%,d CKRi增加了55%。ZVAD-FMK組經(jīng)過IR處理,d CKRi細胞死亡率明顯減少,而p SUPER細胞死亡率無明顯變化。在MDA-MB-231細胞模型中,3-MA和ZVAD-FMK能夠明顯降低IR誘導的細胞死亡,而Rapamycin能夠明顯增加IR誘導的細胞死亡,其中p SUPER增加了64%,d CKRi增加了40%。以上結(jié)果提示d CK對中等劑量輻射誘導的細胞死亡有自噬、凋亡有的參與,而與壞死、鐵死亡無關(guān)。4.d CK Ser-74位點參與抑制凋亡將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p SUPER、d CKRi載體的He La細胞經(jīng)過8Gy照射發(fā)現(xiàn),IR能明顯增加細胞凋亡率,并且He La-d CKRi(20.92%)He La-p SUPER(14.98%)。此外,IR能明顯增加Ceaved-caspase3/caspase3,其中p SUPER增加了134%,d CKRi增加了214%。沉默d CK和IR均可引起B(yǎng)cl-2蛋白表達水平的減少。在SKBR3,MDA-MB-231的細胞模型中,IR能夠明顯Cleaved-PARP/PARP,并且SKBR3-d CKRi(1.92)SKBR3-p SUPER(1.20),MDA-MB-231-d CKRi(3.61)MDAMB-231-p SUPER(1.42)。提示沉默d CK可以增加IR誘導的細胞的凋亡水平。將He La,SKBR3,MDA-MB-231的各組d CK過表達細胞模型經(jīng)過8Gy照射發(fā)現(xiàn),在He La細胞模型中,IR誘導的細胞凋亡增加比例由高到低分別d CK-Vector(88%)d CK-S74A(50%)d CK-WT(29%)d CK-S74E(26%);在SKBR3的細胞模型中,IR誘導的細胞凋亡增加比例由高到低分別為d CK-S74A(107%)d CK-Vector(101%)d CK-WT(64%)d CK-S74E(42%);在MDA-MB-231的細胞模型中,IR誘導的細胞凋亡增加比例由高到低分別為d CK-Vector(463%)d CK-S74A(293%)d CK-WT(190%)d CK-S74E(無變化)。以上結(jié)果提示,d CK通過Ser-74位點的磷酸化抑制IR誘導的細胞凋亡。5.d CK Ser-74位點參與促進自噬將He La-p SUPER和He La-d CKRi細胞給予NH4Cl(30m M)和8Gy照射處理。IR 72h p SUPER細胞MAPLC3-II蛋白表達量與假照組相比明顯增加,而IR 24h,48h LC3-II表達不明顯,提示IR可引起細胞自噬呈時間依賴性增加。加入NH4Cl能明顯增加LC3-II的表達水平。與He La-d CKRi相比,He La-p SUPER在IR 72h LC3-II表達較高。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,IR誘導的He La-d CKRi自噬水平(14.76%)明顯低于He La-p SUPE自噬水平(25.31%)。沉默d CK的SKBR3,MDA-MB-231細胞模型給予8Gy照射,SKBR3-p SUPER細胞的LC3-II/GAPDH增加了52%,而SKBR3-d CKRi細胞的LC3-II/GAPDH變化不明顯。MDA-MB-231-p SUPER細胞的LC3-II/GAPDH增加了91%,而MDA-MB-231-d CKRi細胞的LC3-II/GAPDH僅增加了36%。以上結(jié)果提示d CK可增加IR誘導的細胞自噬水平。將過表達d CK的He La,SKBR3,MDA-MB-231細胞模型給予8Gy照射發(fā)現(xiàn),過表達d CK可明顯增加IR誘導LC3-II的水平。在He La細胞模型中,LC3-II增加水平由高到低分別為S74E(46%)WT(44%)Vector(16%)S74A(9%)。在MDA-MB-231細胞模型中,LC3-II增加水平由高到低分別為S74E(342%)WT(306%)S74A(145%)Vector(無變化)。在SKBR3細胞中,IR可引起d CK-S74E細胞LC3-II表達明顯增加(65%),而其他組細胞模型的LC3-II IR前后LC3-II變化不明顯。以上結(jié)果提示過表達d CK可以增加IR誘導的細胞自噬,并且d CK Ser-74位點的磷酸化參與了自噬的調(diào)控。6.d CK通過Akt/m TOR/P70S6K通路調(diào)控自噬將過表達d CK的He La,MDA-MB-231細胞給予8Gy照射,Western blot檢測Akt/m TOR/P70S6K通路各蛋白顯示,在He La-d CK-WT細胞中,IR處理后phospho-Akt/Akt/GAPDH降低了54%,phospho-m TOR/m TOR/GAPDH降低了39%phospho-P70S6K/P70S6K/GAPDH降低了31%。在He La-d CK-S74E細胞中,IR處理后phospho-Akt/Akt/GAPDH降低了57%,phospho-m TOR/m TOR/GAPDH降低了55%,phospho-P70S6K/P70S6K/GAPDH降低了46%。但He La-d CK-S74A細胞中,IR前后Akt/m TOR/P70S6K通路各蛋白變化不明顯。在轉(zhuǎn)染野生型d CK的MDA-MB-231細胞中,IR處理后phospho-Akt/GAPDH降低了54%,phospho-m TOR/GAPDH降低了82%,phospho-P70S6K/GAPDH降低了54%。在轉(zhuǎn)染d CK-S74E的MDA-MB-231細胞中,IR處理后phospho-Akt/GAPDH降低了57%,phospho-m TOR/GAPDH降低了87%,phospho-P70S6K/GAPDH降低了64%。但在轉(zhuǎn)染d CK-S74A的MDA-MB-231細胞中,IR處理后phospho-Akt/GAPDH,phospho-m TOR/GAPDH,phospho-P70S6K/GAPDH僅分別降低了19%,38%和7%。以上結(jié)果提示d CK通過Akt/m TOR/P70S6K通路調(diào)控IR誘導的細胞自噬。7.自噬與凋亡的轉(zhuǎn)換將He La-p SUPER,He La-d CKRi細胞分別經(jīng)3-MA,ZVAD-FMK或3-MA+ZVAD-FMK預處理1h后給予8Gy照射,Western blot檢測caspase-3及cleaved-caspase3蛋白水平顯示,3-MA可顯著增加各組細胞凋亡水平,其中He La-d CKRi細胞IR誘導的凋亡水平最高。細胞經(jīng)3-MA+ZVAD-FMK共同處理后,凋亡水平明顯低于3-MA處理組中其相應(yīng)凋亡水平,明顯高于ZVAD-FMK處理組中相應(yīng)凋亡水平。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,3-MA可明顯增加IR誘導細胞的凋亡水平,其中He La-p SUPER凋亡增加了32%,He La-d CKRi凋亡增加了48%。He La-d CKRi細胞中,ZVAD-FMK可明顯抑制IR誘導的細胞凋亡(24%),加入3-MA+ZVAD-FMK共同處理后,與control組細胞相比,IR誘導的細胞凋亡無明顯變化,提示3-MA對凋亡的促進作用和ZVAD-FMK對凋亡的抑制作用相互抵消。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn),在MDA-MB-231的細胞模型中,3-MA可明顯抑制IR誘導的細胞凋亡。沉默d CK后,Rapamycin可明顯增加IR誘導的細胞凋亡(32%),而在p SUPER細胞中Rapamycin對IR誘導的凋亡的促進作用不明顯。通過Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),沉默d CK使IR誘導的細胞凋亡增加了17%,加入自噬抑制劑3-MA可顯著抑制細胞凋亡水平,其中沉默d CK的細胞經(jīng)過IR處理后凋亡水平降低最顯著(43%)。此外,3-MA+ZVAD-FMK可明顯抑制細胞凋亡水平,其抑制作用高于3-MA,ZVAD-FMK單獨處理組。提示抑制自噬可抑制IR誘導的細胞凋亡水平,并且3-MA和ZVAD-FMK可協(xié)同抑制細胞凋亡。8.d CK通過調(diào)控G2/M期檢查點保護細胞免于有絲分裂災難流式細胞術(shù)對He La-p SUPER,He La-d CKRi細胞周期相關(guān)指標進行檢測發(fā)現(xiàn),IR可引起細胞G2/M期阻滯,并且G2/M期阻滯具有時間依賴性,在IR處理12h后達到頂峰。此時,沉默d CK后,IR誘導的G2/M期細胞數(shù)明顯低于p SUPER細胞數(shù)。IR能夠促進d CK與Cdk1的結(jié)合,并抑制Cdk1的活性,而d CK Ser74位點的磷酸化對Cdk1活性的抑制具有重要作用。p SUPER細胞經(jīng)過IR處理12h后,有絲分裂細胞減少了70%,在IR處理24h后有所恢復。而在IR處理12h后,沉默d CK對于有絲分裂細胞數(shù)影響很小,但IR誘導的多倍體顯著增加(204%)。此外,沉默d CK可進一步增加IR誘導H2AX的表達,并抑制ERCC1表達。以上結(jié)果提示d CK通過調(diào)控G2/M期檢查點保護細胞免于有絲分裂災難。結(jié)論:1.沉默d CK促進IR誘導的細胞死亡,從而輻射增敏。2.d CK Ser-74位點的磷酸化抑制IR誘導的細胞死亡,具體體現(xiàn)在抑制IR誘導的細胞凋亡,促進IR誘導的細胞自噬,其中自噬與凋亡存在轉(zhuǎn)換關(guān)系。3.d CK通過Akt/m TOR/P70S6K通路調(diào)控IR誘導的細胞自噬。4.d CK通過調(diào)控G2/M期檢查點保護細胞免于有絲分裂災難。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R818

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本文編號：1785219