本文選題：益氣除痰方 + 肺癌　； 參考：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:在益氣除痰方(YQCTF)前期研究基礎(chǔ)上,通過體內(nèi)外雙水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討YQCTF對(duì)腫瘤微環(huán)境血管新生作用的分子機(jī)制及GRP78參與血管新生信號(hào)通路調(diào)控作用,為其抗腫瘤血管新生治療提供臨床應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。方法:體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:廣州中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤中心治療抗腫瘤經(jīng)驗(yàn)方Y(jié)QCTF作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。(1)運(yùn)用CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧模擬細(xì)胞腫瘤缺氧微環(huán)境,采用CCK8法確定CoCl2誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧模型條件以及評(píng)估不同濃度YQCTF干預(yù)缺氧微環(huán)境下HUVEC活性的影響;(2)通過CCK8法確定YQCTF干預(yù)濃度,顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)。利用流式細(xì)胞術(shù)通過AnnexinV/PI染色法檢測細(xì)胞凋亡,通過細(xì)胞DNA含量測定檢測細(xì)胞周期,觀察YQCTF對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡和增殖的影響;(3)采用Tube Formation實(shí)驗(yàn)觀察YQCTF對(duì)缺氧HUVEC血管形成的影響;(4)利用Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)觀察YQCTF對(duì)細(xì)胞遷移侵襲能力和修復(fù)能力的影響。(5)采用QPCR和Western Blot法檢測YQCTF對(duì)缺氧HUVEC中血管新生相關(guān)通路HIF-1 α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAKmRN水平和蛋白表達(dá)及其磷酸化的水平研究YQCTF對(duì)血管新生的調(diào)控作用。(6)通過siRNA干擾技術(shù)沉默GRP78探討GRP78參與調(diào)控血管新生的機(jī)制研究.(7)通過免疫熒光觀察在缺氧、YQCTF干預(yù)及沉默GRP78條件下HUVEC中的GRP78表達(dá)情況,探討YQCTF參與調(diào)控缺氧微環(huán)境細(xì)胞血管新生的分子機(jī)制。體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:選用SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠,構(gòu)建肺腺癌A549細(xì)胞移植瘤裸鼠模型,造移植模型成功后隨機(jī)分為兩組:Control組和YQCTF組。YQCTF組給予每日YQCTF水煎液灌胃,Control組給予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥3周,期間定期觀察移植瘤裸鼠生長狀態(tài),每3d測量裸鼠體重、瘤體體積,移植瘤裸鼠于給藥21d后處死,剝離移植瘤瘤體稱量瘤重、計(jì)算抑瘤率,并觀察肺、肝轉(zhuǎn)移情況,評(píng)估YQCTF對(duì)肺癌腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的影響;采用免疫組化法(IHC)檢測移植瘤組織微血管密度及血管新生相關(guān)信號(hào)通絡(luò)HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK表達(dá)及其磷酸化水平。評(píng)價(jià)YQCTF對(duì)腫瘤血管新生的影響。結(jié)果:體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:(1)CCK8法檢測結(jié)果顯示,缺氧化學(xué)誘導(dǎo)劑CoCl2隨著時(shí)間延長、濃度增高,抑制細(xì)胞活力,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,選擇對(duì)細(xì)胞無明顯抑制活力和增殖的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(100μM,48h)。當(dāng)100μM的CoCl2干預(yù)48h后,細(xì)胞管腔形成、遷移及侵襲能力增強(qiáng)(P0.05,P0.01);(2)CCK8檢測結(jié)果提示提示YQCTF能明顯抑制缺氧HUVEC的細(xì)胞活力(P0.05,P0.01),并與藥物濃度呈依賴性,并隨著YQCTF濃度升高,HUVEC活力下降;(3)通過倒置顯微鏡觀察HUVEC細(xì)胞形態(tài)變化,結(jié)果顯示YQCTF可抑制缺氧HUVEC增殖;(4)流式細(xì)胞儀檢測AnnexinV/PI染色結(jié)果提示YQCTF呈劑量依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P0.05,P0.01),測定細(xì)胞DNA含量結(jié)果顯示YQCTF可顯著增加G0/G1期細(xì)胞的比例,降低S和G2/M比例(P0.05,P0.01),抑制細(xì)胞分裂增殖;(5)Tube Formation實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示YQCTF可顯著抑制細(xì)胞血管形成(P0.05,P0.01)。(6)細(xì)胞劃痕結(jié)果表明YQCTF干預(yù)可明顯抑制細(xì)胞修復(fù)能力(P0.05,P0.01)。(7)Transwell實(shí)驗(yàn)提示YQCT顯著降低缺氧HUVEC細(xì)胞遷移及細(xì)胞侵襲力,可抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移,與藥物濃度呈依賴性(P0.05,P0.01);(8)Western blot和QPCR結(jié)果顯示,缺氧微環(huán)境可顯著上調(diào)血管新生相關(guān)通路信號(hào)分子 HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK 蛋白和 mRNA 表達(dá)水平,并能增強(qiáng)AKT、ERK1/2、FAK磷酸化水平(P0.05,P0.01)。YQCTF干預(yù)后,能顯著下調(diào)細(xì)胞的 HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK 蛋白和 mRNA 表達(dá)水平,抑制AKT、ERK1/2、FAK活性,與YQCTF濃度呈依賴性降低(P0.05,P0.01),提示YQCTF可改善缺氧微環(huán)境,抑制缺氧HUVEC血管生成,其作用機(jī)理可能是通過調(diào)控上述多條信號(hào)通路表達(dá)。(9)免疫熒光結(jié)果顯示,缺氧微環(huán)境下HUVEC的GRP78表達(dá)升高。YQCTF干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜的GRP78熒光強(qiáng)度均降低;(10)siRNA轉(zhuǎn)染HUVEC沉默GRP78表達(dá),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siRNAGRP78后,HUVEC管腔形成、遷移和侵襲能力明顯降低(P0.01);沉默GRP78后,血管新生相關(guān)通路蛋白HIF-1α、VEGF/VEGFR 表達(dá)顯著下調(diào),抑制 AKT、ERK1/2、FAK 激活(P0.05,P0.01),提示GRP78參與血管新生進(jìn)程,干預(yù)缺氧微環(huán)境,介導(dǎo)血管新生信號(hào)通路調(diào)控,對(duì)腫瘤生長轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。(11)免疫熒光結(jié)果顯示,沉默GRP78后,胞內(nèi)和胞膜的GRP78熒光強(qiáng)度都明顯降低,提示GRP78可能是血管新生中重要的靶信號(hào)分子。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:(1)兩組肺癌A549細(xì)胞移植瘤裸鼠模型的體重顯示在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)無明顯差異,YQCTF對(duì)裸鼠體重的生長無顯著抑制,YQCTF可抑制移植瘤瘤體體積(P0.05,P0.01),抑制瘤體腫重量(P0.01),顯示YQCTF對(duì)肺癌細(xì)胞移植瘤的生長有抑制作用。(2)免疫組化結(jié)果顯示,YQFTF組的移植瘤組織微血管密度明顯降低(P0.01),提示YQCTF可抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞血管新生。YQCTF組與Control組相比,可明顯抑制體內(nèi)移植瘤細(xì)胞中HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK 表達(dá)及 AKT、ERK1/2、FAK 磷酸化水平(P0.05,P0.01),提示 YQCTF對(duì)抑制體內(nèi)腫瘤血管新生的J機(jī)制與調(diào)控HIF-Iα、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK1/2、FAK信號(hào)通路表達(dá)相關(guān)。與體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。結(jié)論:1.成功建立缺氧內(nèi)皮細(xì)胞模型和裸鼠肺腺癌細(xì)胞移植瘤動(dòng)物模型。2.體外HUVEC在缺氧條件下血管新生能力增強(qiáng),YQCTF可通過改缺氧微環(huán)境,抑制HUVEC增殖、管腔形成、細(xì)胞遷移和侵襲能力,降低HUVEC血管新生。體內(nèi)YQCTF能顯著降低移植瘤微血管密度,抑制血管生成,抑制肺癌細(xì)胞生長增殖。3.YQCTF抗腫瘤血管新生機(jī)制可通過多途徑、多靶點(diǎn)抑制HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK1/2、FAK信號(hào)通路表達(dá)。4.GRP78參與血管新生信號(hào)通路調(diào)控。缺氧微環(huán)境可誘導(dǎo)GRP78表達(dá)升高,GRP78可能通過調(diào)控HIF-1 α、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK信號(hào)通路參與腫瘤血管形成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1731988