本文選題：肝細(xì)胞癌　切入點：乙肝病毒X基因　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：【研究背景】全球范圍內(nèi)有超過2.4億人發(fā)生慢性乙肝的感染,每年約有60萬人因為HBV感染所致肝病死亡。在亞洲及撒哈拉以南的非洲地區(qū),因為HBV感染的流行,HCC發(fā)生明顯高于其他地區(qū)。HCC發(fā)生最為相關(guān)的危險因素就是HBV感染,HBx蛋白作為HBV編碼的最小蛋白,具有反式激活因子功能,可以通過蛋白與蛋白之間的相互作用,刺激病毒復(fù)制或改變宿主基因的表達(dá),從而促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展。由于HBV病毒在復(fù)制過程中缺乏校正功能,所以HBV基因常常發(fā)生突變。HCC病人就經(jīng)常發(fā)現(xiàn)HBx基因突變,并且HBx基因的突變在HCC發(fā)生發(fā)展的過程中是逐漸累積的。與HCC發(fā)生風(fēng)險相關(guān)的常見HBx突變有G1613A、C1653T、T1674C/G、T1753V、T1768A以及A1762T/G1764A雙突變。轉(zhuǎn)染含有這些突變的HBx質(zhì)粒可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖遷移能力。然而目前的研究都是從單一的分子或是信號通路著手,利用生物信息學(xué)的方法,從促炎促癌信號網(wǎng)絡(luò)解釋HBx基因突變是如何促進(jìn)肝癌發(fā)生的研究目前還十分缺乏。【研究目的】本研究利用生物信息學(xué)的方法,以炎癥信號網(wǎng)絡(luò)為著手點,研究HBx基因突變是如何通過改變炎癥或是促癌信號網(wǎng)絡(luò)來促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的。為尋找HBV-HCC診斷和治療新靶點奠定基礎(chǔ)。【研究方法】首先通過PCR的方法,以HCC病人血清中提取的HBV DNA為模板擴增HBx基因片段,并構(gòu)建相應(yīng)的慢病毒及睡美人轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒。其中包括野生型、突變型以及C端截短型的HBx。利用慢病毒載體及睡美人轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒,在肝癌HepG2細(xì)胞及睡美人小鼠中成功表達(dá)HBx蛋白。通過檢測HepG2細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力,明確突變型HBx在肝癌細(xì)胞內(nèi)的致癌能力;通過檢測小鼠生癌及炎癥因子表達(dá)情況,明確突變型HBx在動物體內(nèi)的促炎、促癌能力。其次,分析HTA2.0芯片信噪比富集GSEA基因項,對富集到的基因繪制蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),在最致密的蛋白-蛋白相互作用模塊中尋找突變型HBx與野生型HBx相比差異較大的關(guān)鍵節(jié)點分子。緊接著在HTA2.0及Agilent芯片中,通過突變型HBx與野生型HBx比較得到的差異基因富集GSEA基因項,并找到HTA2.0及Agilent芯片中共有的基因項,從而尋找HBx基因突變在體內(nèi)外實驗中共同改變的促炎促癌信號通路。最后在細(xì)胞及小鼠體內(nèi)驗證候選的炎癥信號通路及關(guān)鍵調(diào)控分子,找到HBx突變調(diào)控的關(guān)鍵基因。【研究結(jié)果】1.通過PCR的方法,以病人血清中提取的HBV DNA為模板,擴增突變型、C端截短型及野生型HBx片段并構(gòu)建到慢病毒及睡美人轉(zhuǎn)座子中,各種突變型hbx片段涉及到的hcc及肝硬化相關(guān)突變?nèi)缦?m1突變型:a1727g+a1762t/g1764a;m2突變型:t1753a+a1762t/g1764a;m3突變型:a1762t/g1764a;m4突變型:c1653t+t1674g+a1762t/g1764ac端截短型:nt.1733位點g→a突變,原密碼子由tgg變?yōu)榻K止密碼子tga從而發(fā)生截短。首先,通過慢病毒系統(tǒng)成功在hepg2細(xì)胞中表達(dá)各種突變型、c端截短型以及野生型hbx蛋白。其次,通過細(xì)胞周期、增殖、遷移及侵襲實驗發(fā)現(xiàn),與野生型hbx相比,突變型hbx可以加速細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞增殖。表達(dá)m3、m4、ct型hbx的hepg2細(xì)胞處于s期的比例要高于表達(dá)野生型hbx的細(xì)胞(p值分別為0.016,0.006以及0.024)。表達(dá)m4突變型hbx的hepg2細(xì)胞增殖能力明顯比表達(dá)野生型hbx以及空載體組的細(xì)胞要高(p值分別為0.001和0.001)。裸鼠成瘤實驗也發(fā)現(xiàn),m4突變型組裸鼠皮下腫瘤重量要明顯高于野生型組(p=0.039)。2.利用睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在睡美人小鼠肝臟中成功表達(dá)突變型、c端截短型以及野生型hbx蛋白。統(tǒng)計小鼠肝臟生瘤情況發(fā)現(xiàn),突變型、c端截短型組小鼠的生瘤率及生瘤大小要普遍高于野生型組。m4突變及c端截短型組生瘤率顯著高于野生型、空載體組(m4vs.wt,p=0.010;m4vs.vector,p0.001;ctvs.vector,p=0.019)。突變型組小鼠的腫瘤與肝臟重量比值要高于野生型及空載體組,其中m4突變型組顯著高于野生型及空載體組(p值分別為0.012和0.005)。同時,檢測小鼠血清炎癥因子的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)m4突變型組il-6表達(dá)水平要顯著高于空載體組(p=0.024);m4突變型組il-5表達(dá)水平要顯著高于野生型及空載體組(p值分別為0.010和0.043);m4突變型組ifn-γ的表達(dá)水平要顯著高于野生型及空載體組(p值分別為0.029和0.005);突變型組中,il-1β、il-12p70、ifn-α以及il-4的檢出率均高于野生型或空載體組。3.hta2.0芯片通過信噪比富集gsea基因項并繪制蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過突變型hbx與野生型hbx組相比,在最致密的蛋白-蛋白相互作用模塊中尋找差異關(guān)鍵節(jié)點分子:cdc20、pai-1等。利用hta2.0及agilent芯片差異基因富集gsea基因集,并找到共同富集到的gsea基因項,其中包括il-6炎癥信號通路及部分癌癥相關(guān)信號通路。4.通過rt-qpcr實驗發(fā)現(xiàn)hepg2細(xì)胞中,突變型及c端截短型組cdc20mRNA水平顯著高于野生型組(M3 vs.Wt,p=0.026;M4 vs.Wt,p0.001;Ct vs.Wt,p0.001);PAI-1 mRNA水平也具有相同的結(jié)果(M4 vs.Wt,p=0.001;Ct vs.Wt,p0.001)。蛋白水平檢測明確了突變型HBx較野生型HBx上調(diào)CDC20、PAI-1基因的表達(dá)的能力更強;這在小鼠肝臟免疫組化結(jié)果中同樣被證實。小鼠炎癥因子檢測則明確了M4突變型組IL-6表達(dá)水平顯著高于野生型組或空載體組(p值分別為0.083和0.024)。以上結(jié)果證明了與野生型HBx相比,突變型HBx更能促進(jìn)IL-6通路的激活以及CDC20和PAI-1基因的表達(dá)。5.M4突變型HBx較野生型HBx能夠顯著提高HepG2細(xì)胞的增殖能力,當(dāng)敲低CDC20或PAI-1基因表達(dá)后,瞬時轉(zhuǎn)染含有M4突變型HBx或野生型HBx的質(zhì)粒,兩組HepG2細(xì)胞增殖能力相當(dāng)。因此,推斷突變型HBx是通過上調(diào)CDC20、PAI-1基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖的。【研究結(jié)論】突變型較野生型HBx具有更強的促炎、促細(xì)胞增殖等致癌能力。并且,與野生型HBx相比,突變型HBx可以通過促進(jìn)CDC20、PAI-1基因的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖,從而促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程.
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62;R735.7

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本文編號：1727951