本文選題：鼻黏膜　切入點(diǎn)：外胚間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《江蘇大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的：外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(Ecto-mesenchymal stem cells, EMSCs)是間充質(zhì)干細(xì)胞的特殊類型,起源于胚胎時(shí)期的神經(jīng)嵴(Neural crest),具有自我更新和多向分化潛能。本研究旨在探討大鼠鼻黏膜來源的EMSCs的干細(xì)胞特性和多向分化潛能,并探討其在纖維蛋白(Fibrin)支架上的多向分化潛能,為組織工程干細(xì)胞／支架移植尋找新的種子細(xì)胞。最后,將EMSCs/Fibrin支架移植到大鼠脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)模型,評價(jià)其對脊髓損傷的修復(fù)效果。方法:1.制作大鼠鼻黏膜冰凍切片,用EMSCs標(biāo)志蛋白Nestin, CD133, CD44進(jìn)行免疫熒光染色,觀察其在大鼠鼻黏膜的分布特征。2.用差速貼壁法純化EMSCs,并用成球?qū)嶒?yàn)及各種干細(xì)胞標(biāo)志蛋白評價(jià)其干細(xì)胞特性。3.用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)EMSCs向成骨細(xì)胞分化。用堿性磷酸酶染色檢測堿性磷酸酶活性；茜素紅染色檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞表面鈣結(jié)節(jié)來評價(jià)成骨誘導(dǎo)效果；用免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測Collagen-Ⅰ、Osteocalcin、Osteopuntin及Runx2的表達(dá)水平評價(jià)EMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效果。4.用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)EMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。用神經(jīng)標(biāo)志蛋白Synapsin, Synaptotagmin, GAP43及NF-200進(jìn)行免疫熒光和蛋白免疫印跡,評價(jià)EMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化效果。5.用雪旺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)EMSCs向雪旺細(xì)胞分化。用雪旺細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP, p75, S100β, CNPase進(jìn)行免疫熒光和蛋白免疫印跡,評價(jià)EMSCs向雪旺細(xì)胞的分化效果。6.EMSCs與大鼠脊髓來源神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行Transwell非接觸共培養(yǎng),免疫熒光檢測評價(jià)該體系下EMSCs對神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響。7.EMSCs與大鼠脊髓來源神經(jīng)干細(xì)胞接觸共培養(yǎng),活細(xì)胞動態(tài)攝影及免疫熒光檢測評價(jià)該體系下EMSCs對神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響。8.接觸共培養(yǎng)體系中加入RGD, Integrinβ1抗體及BOC抗體,觀察并簡要探討RGD, Integrinβ1抗體及BOC抗體對神經(jīng)干細(xì)胞分化的抑制作用。9.用掃描電子顯微鏡檢測(Scanning electron microscopy, SEM)及透射電子顯微鏡檢測(Transmission electron microscopy, TEM)觀察Fibrin支架的結(jié)構(gòu)特征。EMSCs種植于Fibrin支架后,用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin, HE)染色評價(jià)EMSCs與Fibrin支架的生物相容性。10.用免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測EMSCs在Fibrin支架上的自發(fā)分化情況。11用免疫熒光、蛋白免疫印跡、SEM和TEM等方法檢測EMSCs在Fibrin支架上向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和雪旺細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效果(方法同上述3-5)。12.將EMSCs/Fibrin支架移植入大鼠脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)模型,觀察EMSCs在脊髓的遷移情況,BBB評分(Basso-, Beattie, Bresnahan scoring)評價(jià)大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)情況。用免疫熒光、免疫組化、TEM及蛋白免疫印跡等方法觀察評價(jià)損傷脊髓神經(jīng)元的再生情況。結(jié)果：1.鼻黏膜組織冰凍切片免疫熒光染色顯示,CD 133, Nestin及CD44陽性細(xì)胞廣泛分布于鼻中隔兩側(cè)黏膜固有層內(nèi)。2.EMSCs在抗貼壁培養(yǎng)時(shí),可形成CD 133, Nestin及Soxl陽性的干細(xì)胞球。差速貼壁純化后的第三代EMSCs顯示出很強(qiáng)的干性,表達(dá)神經(jīng)外胚層干細(xì)胞相關(guān)蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nestin, Soxl, Sox10, S100, Snail, Vimentin, CD44, CD133, Sall4及含RGD序列細(xì)胞外基質(zhì)的受體integrinβ1等。3.EMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)2周后,堿性磷酸酶活性明顯增強(qiáng),成骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白Collagen-Ⅰ、Osteocalcin、Osteopuntin及Runx2的表達(dá)量明顯升高。誘導(dǎo)3周后,茜素紅染色可觀察到大量的鈣結(jié)節(jié)。4. EMSCs用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后,神經(jīng)標(biāo)志蛋白Synapsin, Synaptotagmin, GAP43及NF-200的表達(dá)量明顯升高。5. EMSCs用雪旺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后,雪旺細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP, p75, S100β, CNPase的表達(dá)量明顯升高。6. EMSCs與脊髓來源的神經(jīng)干細(xì)胞的Transwell非接觸共培養(yǎng)結(jié)果顯示,共培養(yǎng)組神經(jīng)突觸的數(shù)量和長度明顯增加,并可形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。7.EMSCs與脊髓來源的神經(jīng)干細(xì)胞接觸共培養(yǎng)結(jié)果顯示,單神經(jīng)細(xì)胞組細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GAP43及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP,而共培養(yǎng)組只表達(dá)GAP43,不表達(dá)GFAP。8.接觸共培養(yǎng)體系中加入RGD, Integrinβ1抗體及BOC抗體后,神經(jīng)纖維的生長受到抑制。9.SEM和TEM檢測不同濃度Fibrin支架的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)低濃度(12.5-50mg/ml)的Fibrin支架呈疏松多孔的海綿狀結(jié)構(gòu),并且隨著濃度升高,孔徑減小,密度增加。而當(dāng)纖維蛋白濃度達(dá)到75 mg/ml,纖維蛋白膠則聚集成塊狀結(jié)構(gòu)。HE染色結(jié)果顯示,EMSCs在低濃度Fibrin支架上生長良好。10.免疫熒光和蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,EMSCs在Fibrin支架上培養(yǎng)12天后,可表達(dá)雪旺細(xì)胞標(biāo)志蛋白CNPase, MBP, GalCer及雪旺細(xì)胞可分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF, NGF, NT-3等。11.免疫熒光、蛋白免疫印跡、SEM和TEM等結(jié)果顯示,EMSCs在Fibrin支架上也可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及雪旺細(xì)胞,并且分化效果優(yōu)于在L-多聚賴氨酸(poly-L-Lysine, PLL)對照組,而且EMSCs能夠改建Fibrin支架,使其更利于細(xì)胞的生長。12.將EMSCs/Fibrin支架移植入大鼠脊髓損傷模型,可觀察到EMSCs從移植處向脊髓兩端遷移。術(shù)后12周BBB評分結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)情況良好,而對照組無明顯恢復(fù)。免疫熒光、免疫組化、TEM及蛋白免疫印跡等結(jié)果顯示,EMSCs/Fibrin移植組神經(jīng)再生相關(guān)蛋白GAP43, NF-200及MBP的表達(dá)量明顯高于SCI組及Fibrin組,神經(jīng)再生能力明顯提高,神經(jīng)細(xì)胞被很厚的髓鞘包被。結(jié)論：1. EMSCs廣泛分布于嗅部和呼吸部黏膜固有層內(nèi),并具有很強(qiáng)的干性,具有向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及雪旺細(xì)胞分化的潛能。2.EMSCS與Fibrin支架生物相容性良好,并能在Fibrin支架上自發(fā)分化為雪旺細(xì)胞。3.EMSCs在Fibrin支架上能更有效的分化為成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和雪旺細(xì)胞,并可以改建Fibrin支架,使之更利于EMSCs的生長分化。4.EMSCs/Fibrin支架移植到大鼠橫斷脊髓損傷模型,能有效恢復(fù)大鼠后肢運(yùn)動功能。EMSCs是組織工程中一種很有利用前景的種子細(xì)胞,可用于自體移植修復(fù)脊髓損傷。
[Abstract]:Objective : To investigate the specific types of mesenchymal stem cells ( EMSCs ) in rat nasal mucosa .
Alizarin red staining was used to evaluate the osteoinductive effect of calcium nodules on the surface of the cells after induction .
The effect of EMSCs on the differentiation of neural stem cells to cultured Schwann cells was evaluated by immunofluorescence , Western blot , SEM and TEM . After 3 weeks of induction , alizarin red staining observed a large number of calcium nodules . The expression of Synapsin , Synaptotagmin , gap43 and NF - 200 in EMSCs was significantly increased after 14 days of induction culture with neural - induced culture medium . The expression of GFAP , p75 , S100 尾 and CNPase in Schwann cells increased significantly after cultured for 14 days with Schwann cells induced by Schwann cells . The results showed that EMSCs could induce differentiation into osteoblasts , nerve cells and Schwann cells . The results showed that EMSCs could induce differentiation into osteoblasts , nerve cells and Schwann cells . EMSCs can differentiate into osteoblasts , nerve cells and Schwann cells . EMSCs can differentiate into osteoblasts , neural cells and Schwann cells .

【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2;R446.6

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本文編號：1716993