本文選題：人小涎腺上皮干/祖細(xì)胞　切入點(diǎn)：人小涎腺間充干細(xì)胞　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：研究背景口干癥等唾液腺疾病嚴(yán)重影響人類的身體健康和生活質(zhì)量。迄今為止,主要通過保守治療改善癥狀,尚無一種根本有效的治療方法。干細(xì)胞治療或生物工程化唾液腺類器官的構(gòu)建為其治療提供了新的方法和思路。近些年來,唾液腺來源的干細(xì)胞相關(guān)研究成為新熱點(diǎn),研究方向主要集中于大涎腺。與之不同的是,我們課題組基于小涎腺組織具有數(shù)量多、分布廣泛、來源豐富、解剖部位淺、取材方便、供區(qū)隱蔽等優(yōu)點(diǎn),率先開展了人小涎腺來源的干細(xì)胞研究,從小涎腺中分離培養(yǎng)并鑒定上皮干/祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞兩種成體干細(xì)胞。在本實驗中,我們應(yīng)用人小涎腺來源的上皮干/祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行生物工程化人唾液腺類器官的體內(nèi)外研究,在組織細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)水平對重構(gòu)的人唾液腺類器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行初步分析。人唾液腺類器官體內(nèi)外模型的建立,將對唾液腺的發(fā)育、生理功能、唾液成分分析和唾液腺疾病發(fā)生機(jī)制等研究具有重要的理論意義和轉(zhuǎn)化價值。研究目的1.人小涎腺組織分離培養(yǎng)和鑒定后的上皮干/祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外三維培養(yǎng),探討體外構(gòu)建具有一定功能和功能的生物工程化人唾液腺類器官的可行性。2.將人小涎腺組織分離培養(yǎng)和鑒定后的上皮干/祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞移植入小鼠體內(nèi),構(gòu)建人唾液腺類器官的體內(nèi)模型。研究內(nèi)容1.生物工程化人唾液腺類器官的體外重構(gòu)方法人小涎腺上皮干/祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞在基質(zhì)膠Matrigel內(nèi)進(jìn)行分別和混合三維培養(yǎng)。以平面培養(yǎng)作為對照,觀察其形態(tài)學(xué)變化,RT-PCR方法檢測各組內(nèi)不同時相和組間的AMY1 AQP5、MUC5B、LZM、CK14、CK15、CK19 和Ki67 基因表達(dá)變化;收集平面培養(yǎng)和立體培養(yǎng)的第6天、12天、18天、24天和30天上清液,應(yīng)用ELISA試劑盒檢測AMY1和LZM的分泌水平變化;標(biāo)本進(jìn)行HE染色,應(yīng)用免疫熒光檢測 AQP5、CK14、CK15、CK19、CD44、CD166、Calponin、Claudin1、NKCC1、E-cadherin、ZO-1、α-SMA和NF-H等目標(biāo)蛋白的表達(dá)。結(jié)果hMSGSC與hMSGMSC混合接種至Matrigel后36-48小時左右后即可觀察到兼有導(dǎo)管和腺泡樣結(jié)構(gòu)的類器官形成,而兩種細(xì)胞單獨(dú)接種時均不能形成導(dǎo)管分支樣結(jié)構(gòu)的類器官體。兩種細(xì)胞通過不同熒光蛋白分別標(biāo)記并體外立體培養(yǎng)后,在共聚焦顯微鏡下可以觀察到形成類器官體中導(dǎo)管和腺泡樣結(jié)構(gòu)主要由hMSGSC構(gòu)成。hMSGSC 組 AMY1、AQP5、LZM 和 MUC5B 表達(dá)高于 hMSGMSC 和hMSGSC+hMSGMSC 組,hMSGSC+hMSGMSC 組的 AMY1 水平高于 hMSGMSC 組。hMSGSC 和 hMSGSC+hMSGMSC 組 CK14、CK15 和 CK19 表達(dá)量高,hMSGMSC 組表達(dá)量極低;Ki67的表達(dá)量從高到低為hMSGMSC、hMSGSC和hMSGSC +hMSGMSC,立體培養(yǎng)后表達(dá)量降低。hMSGSC+hMSGMSC組HE染色可見末端膨大的球狀細(xì)胞團(tuán)和其間相互連接的分支樣結(jié)構(gòu)。小涎腺組織腺管位置表達(dá)的CK15、CK19,在腺泡表達(dá)的CD44,腺泡和腺管位置均表達(dá)的CK14,在hMSGSC平面培養(yǎng)和立體培養(yǎng)、hMSGSC+hMSGMSC立體培養(yǎng)時均表達(dá)。hMSGSC和hMSGSC+hMSGMSC立體培養(yǎng)還高表達(dá)在小涎腺腺泡部位特異表達(dá)的AQP5。hMSGMSC平面和立體培養(yǎng)基本未見表達(dá)。hMSGSC +hMSGMSC組上清液中LZM的濃度均明顯高于hMSGSC組,hMSGMSC組上清液原液LZM濃度過低基本檢測不到。hMSGMSC和hMSGSC+hMSGMSC組上清液中AMY1的濃度均高于hMSGSC組;前兩組之間多數(shù)時相點(diǎn)分泌濃度無明顯差別。結(jié)論hMSGSC與hMSGMSC體外立體共培養(yǎng)后可以觀察腺泡和導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的分支狀形態(tài)、表達(dá)相關(guān)免疫表型、具有一定功能的人唾液腺類器官。2.生物工程化人唾液腺類器官構(gòu)建的體內(nèi)研究方法將人小涎腺組織上皮干/祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞體外分別、共同種植于SD大鼠鼠尾膠原內(nèi),體外培養(yǎng)3-5天后,同時將空白大鼠鼠尾膠原和新鮮人小涎腺組織分別作為對照,移植入裸鼠皮下。體內(nèi)移植實驗后2周、4周分別予以取材,行切片HE、PAS染色和免疫熒光檢測。結(jié)果取材標(biāo)本內(nèi)可見標(biāo)記過的人小涎腺干細(xì)胞。鼠尾膠原空白組可見少量細(xì)胞浸潤。HE染色和PAS染色發(fā)現(xiàn)只有hMSGSC+hMSGMSC混合組在體內(nèi)血管化較好,形成較為明顯腺管樣結(jié)構(gòu),其周緣可見空泡狀類腺泡結(jié)構(gòu)。免疫熒光檢測可見腺泡較為特異性表達(dá)的AQP5、CD166(4周)和Calponin在網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)表達(dá),腺管特異性標(biāo)記CK19均在腺管樣結(jié)構(gòu)中表達(dá)。人小涎腺在裸鼠體內(nèi)移植后,小涎腺原有的腺泡和腺管均萎縮較明顯,但在周緣可見與hMSGSC+hMSGMSC混合組體內(nèi)移植相似的腺管樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論hMSGSC和hMSGMSC混合共培養(yǎng)體內(nèi)移植可成活,并形成有典型腺管樣結(jié)構(gòu)和空泡狀類腺泡結(jié)構(gòu)的人唾液腺類器官。
[Abstract]:Objective 1 . To study the structure and function of salivary gland organs in human salivary glands . The expression of AMY1 , AQP5 , LZM and MUC5B in hMSGSCs and hMSgmsc groups were significantly higher than that in hMSgmsc group . Conclusion : The expression of AQP5 , CD166 ( 4 - week ) and Callazide in the salivary gland in nude mice showed that both AQP5 , CD166 ( 4 - week ) and Callazide - like structure expressed in the acinar - like structure , and the acinar - specific markers CK19 were expressed in the glandular - tube - like structure .

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R318.1;R781.7

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本文編號：1713863