本文選題：高遷移率族蛋白N2　切入點：嵌合抗原受體　出處：《鄭州大學》2017年博士論文

【摘要】：背景盡管手術(shù)、放療和化療治療惡性腫瘤在降低患者死亡率,提高生活質(zhì)量方面取得了一定的進展。但是,手術(shù)治療易復發(fā),放、化療毒副作用大,不良反應(yīng)較多,患者在治療過程中需承受巨大痛苦仍然難以治愈。近年來,應(yīng)用改造的淋巴細胞做細胞免疫治療取得了巨大的成功。這些免疫治療的設(shè)計都是給腫瘤患者輸注體外激活的淋巴細胞,希望進入體內(nèi)的淋巴細胞能夠殺傷和清除腫瘤細胞。免疫治療的方式也在治療實踐中一步一步的發(fā)展和改進,從最初的培養(yǎng)腫瘤部位洗脫的TIL細胞,再到IL-2刺激生長的LAK細胞,用多種細胞因子刺激的CIK細胞,用腫瘤抗原肽激活的CTL細胞等等。這些免疫療法效果都有限。直到近年出現(xiàn)的嵌合抗原受體T細胞(CAR T),細胞免疫治療才真正進入了臨床腫瘤治療的階段。分析CAR T細胞取得成功的原因,是其初步解決了2個關(guān)鍵性問題,一是以往培養(yǎng)后獲取的有活性的淋巴細胞難以在體內(nèi)大量生長,不能持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤作用。CAR T細胞改造中給T細胞引入T細胞受體嵌合序列CD8A-CD28-CD137-CD3ζ,誘導其在體內(nèi)外都能大量擴增,長期存活。二是給T細胞裝備識別腫瘤的眼睛,能夠特異性識別腫瘤抗原。以目前臨床最有成效的CD19-CAR T來說,其T細胞受體識別抗原肽的片段改裝為抗CD19抗體,急性淋巴細胞白血病和慢性淋巴細胞白血病細胞都有CD19抗原,可以被特異性識別和殺傷。盡管有此成就,CAR T細胞的缺陷也開始顯現(xiàn)。在臨床抗腫瘤過程中致死性的細胞因子風暴、耐藥性和脫靶效應(yīng)等問題也逐漸出現(xiàn),尤其CD19-CAR T細胞,除殺傷CD19+白血病細胞外還殺傷正常B淋巴細胞,引起低免疫球蛋白血癥,是最終導致患者感染死亡的重要隱患。究其原因,是迄今并未找到急慢性淋巴細胞白血病特異性標志物,治療設(shè)計只是針對白血病細胞經(jīng)常出現(xiàn)的CD19抗原,而CD19抗原也出現(xiàn)在正常B細胞上。目前細胞免疫治療迫切需要腫瘤細胞的特異性標志物。本文發(fā)現(xiàn),高遷移率族蛋白N2(High Mobility Group Chromosal Protein N2,HMGN2)是一個值得關(guān)注的蛋白。HMGN2對乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤細胞具有趨向性和特異性結(jié)合識別能力,同時也可增強細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞等免疫細胞的抗腫瘤效應(yīng)。本文擬構(gòu)建HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ融合基因慢病毒載體,轉(zhuǎn)染制備重組的T細胞(簡稱HMGN2-T細胞),觀察其抗腫瘤潛力。目的探索表達HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ融合蛋白的HMGN2-T細胞是否能獲得體外大量增殖及特異性殺傷腫瘤細胞的功能,有用于臨床腫瘤治療的可能性。方法1.構(gòu)建HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ融合蛋白相關(guān)基因。收集正常人外周血,提取單個核細胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,設(shè)計引物應(yīng)用PCR分別擴增特異性腫瘤細胞粘附分子HMGN2、跨膜區(qū)和鉸鏈區(qū)CD8A、胞內(nèi)共刺激信號區(qū)CD28和CD137、信號傳導區(qū)CD3ζ5個基因編碼區(qū)全長,凝膠純化目的基因DNA。將HMGN2、CD8A、CD28、CD137、CD3ζ5個基因進行TA克隆,挑菌落進行培養(yǎng)測序。將測序正確的菌落重新培養(yǎng),提取純化質(zhì)粒DNA。2.利用分子生物學技術(shù)將HMGN2、CD8A、CD28、CD137、CD3ζ的編碼序列按順序連接起來,構(gòu)建HMGN2融合基因重組質(zhì)粒載體,PCR和基因測序技術(shù)鑒定重組基因序列完全正確后進行慢病毒包裝、濃縮純化及病毒滴度測定。使其可以合成HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ重組融合蛋白。3.用慢病毒包裝HMGN2融合基因經(jīng)感染Jurkat細胞制備HMGN2-T細胞。應(yīng)用熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)檢測HMGN2融合蛋白在HMGN2-T細胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒Jurkat細胞的表達情況。測定HMGN2-T細胞增殖能力,包括CCK-8法檢測HMGN2-T細胞增殖能力;ELISA法檢測HMGN2-T細胞細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌情況;流式細胞術(shù)Annexin v-PE/7-AAD雙染法檢測HMGN2-T細胞凋亡情況;流式細胞術(shù)PI單染法檢測HMGN2-T細胞周期DNA含量改變。4.HMGN2-T細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)過程中細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌水平發(fā)生改變以及抗腫瘤作用。ELISA法檢測HMGN2-T細胞在抗腫瘤過程中細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌水平的改變。用乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性實驗檢測HMGN2-T細胞分別與宮頸癌Hela細胞系、肺癌LLC細胞系、肝癌Hep G2細胞系、乳腺癌MCF7細胞系共培養(yǎng)過程中的殺傷能力。結(jié)果1從正常人外周血基因組RNA中獲得了HMGN2、CD8A、CD28、CD137、CD3ζ5個基因并構(gòu)建完整質(zhì)粒從正常人外周血提取單個核細胞,提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,應(yīng)用PCR技術(shù)分別擴增出特異性腫瘤細胞粘附分子HMGN2(273bp)、跨膜區(qū)和鉸鏈區(qū)CD8A(708bp)、胞內(nèi)共刺激信號區(qū)CD28(663bp)和CD137(768bp)、信號傳導區(qū)CD3ζ(492 bp)5個基因編碼區(qū)全長,凝膠純化DNA。將純化后的DNA通過分子克隆技術(shù)分別構(gòu)建HMGN2-p GM-T、CD8A-p GM-T、CD28-p GM-T、CD137-p GM-T、CD3ζ-p GM-T質(zhì)粒載體,挑克隆基因測序正確。HMGN2融合蛋白慢病毒2重組HMGN2融合蛋白GV358質(zhì)粒并獲得能用于轉(zhuǎn)染T細胞的應(yīng)用PCR技術(shù)將5個基因進行連接,構(gòu)建HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ(2880bp)GV358質(zhì)粒載體,挑克隆基因測序正確。將新合成的HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ重組融合蛋白命名為HMGN2融合蛋白。采用GV358載體、Helper 1.0載體、Helper 2.0載體共轉(zhuǎn)染293T細胞,72h后收集細胞上清液,離心濃縮去除雜質(zhì)后進行慢病毒的濃縮和純化。檢測HMGN2融合蛋白慢病毒滴度結(jié)果為1×108Tu/ml,HMGN2融合蛋白慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞72小時后在倒置熒光顯微鏡下拍照,見到攜帶大量綠色熒光的細胞,且細胞熒光率達70%以上;PCR擴增出HMGN2融合蛋白目的基因全長,說明慢病毒包裝成功,可以進行HMGN2融合蛋白功能測定。3慢病毒包裝HMGN2融合基因轉(zhuǎn)染Jurkat細胞制備HMGN2-T細胞用包裝HMGN2融合基因的慢病毒感染Jurkat細胞,成功制備了表達HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ融合蛋白的重組T細胞(簡稱HMGN2-T細胞)。培養(yǎng)72h后在普通顯微鏡下觀察,可以見到HMGN2-T細胞折光性強,生長狀態(tài)良好。熒光顯微鏡下看到大量HMGN2-T細胞攜帶綠色熒光,對照組未轉(zhuǎn)HMGN2融合基因的Jurkat細胞為陰性。流式細胞術(shù)檢測HMGN2融合基因轉(zhuǎn)染Jurkat細胞獲得HMGN2-T細胞的成功率達78.33%。提取HMGN2-T細胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Jurkat細胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,進行PCR,HMGN2-T細胞可擴增出HMGN2融合蛋白基因全長,基因測序正確;轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Jurkat細胞為陰性。應(yīng)用CCK-8法檢測HMGN2-T細胞在24h、48h、72h細胞增殖作用。分別與未轉(zhuǎn)染病毒的Jurkat細胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Jurkat細胞相比,HMGN2-T細胞在24h增殖作用(0.404±0.075)與對照組(0.363±0.103,0.371±0.097)相比沒有明顯差別(P=0.499),但在48h、72h的增殖作用(0.787±0.206,0.931±0.273)與對照組相比有明顯增強,增殖速率分別為48.66%、56.60%,說明HMGN2-T細胞增殖作用增加,并且隨著時間延長HMGN2融合蛋白可顯著促進HMGN2-T細胞增殖(P=0.001)。4 HMGN2-T細胞的細胞因子IL-2,TNF-α分泌增多,IFN-γ分泌水平無改變應(yīng)用ELISA法檢測HMGN2-T細胞不同時間點細胞因子IL-2,TNF-α,IFN-γ分泌情況。實驗結(jié)果表明HMGN2-T細胞在24h、48h細胞因子IL-2的分泌量(1054.205±94.815,1680.705±119.437)pg/ml要明顯高于未轉(zhuǎn)染病毒的Jurkat細胞(795.25±16.263,882.735±36.790)pg/ml和轉(zhuǎn)染GV358空質(zhì)粒的Jurkat細胞(540.46±8.188,801.735±25.434)pg/ml在相同時間點的分泌水平(P0.05),隨著時間延長HMGN2-T細胞IL-2分泌量以1.5倍的速度增長(P=0.009)。HMGN2-T細胞在24h、48h細胞因子TNF-α的分泌量(305.373±16.598,662.534±48.485)pg/ml要明顯高于未轉(zhuǎn)染病毒的Jurkat細胞(164.408±16.519,348.421±12.517)pg/ml和轉(zhuǎn)染GV358空質(zhì)粒的Jurkat細胞(270.701±18.990,271.977±4.917)pg/ml在相同時間點的分泌水平(P0.05),HMGN2-T細胞IL-2,TNF-α分泌水平都有隨著時間逐漸增多的趨勢。HMGN2-T細胞IFN-γ在48h的分泌水平(1040.59±174.259,1013.652±84.402,1042.767±117.305)pg/ml在三組之間無明顯改變(P=0.991),且在不同時間點無差異性改變(P=0.764)。5 HMGN2-T細胞增殖速率明顯增加,凋亡代謝率增快應(yīng)用流式細胞術(shù)PI單染法檢測HMGN2融合蛋白在轉(zhuǎn)染Jurkat細胞24h、48h后細胞周期DNA含量改變。HMGN2-T細胞與轉(zhuǎn)染GV358空質(zhì)粒的Jurkat細胞在轉(zhuǎn)染后24h相比,G0/G1期細胞減少13.63%(38.926%±0.628 VS 52.556%±5.408),S期細胞增加15.1%(55.94%±2.032 VS 40.846%±7.387),G2/M期細胞變化不明顯(5.133%±1.532 VS 6.6%±1.992);轉(zhuǎn)染后48h HMGN2-T細胞與轉(zhuǎn)染GV358空質(zhì)粒的Jurkat細胞相比,G0/G1期細胞減少8.72%(41.393%±3.425 VS50.116%±8.575),S期細胞增加2.14%(47.3%±12.708 VS 45.163%±6.475),G2/M期細胞增多1.92%(6.663%±3.133 VS 4.716%±2.511),說明轉(zhuǎn)染HMGN2融合蛋白的Jurkat細胞與對照組相比,G0/G1期細胞減少,S期和G2/M期細胞增多,細胞增殖速率明顯增加。流式細胞術(shù)Annexin v-PE/7-AAD雙染法檢測HMGN2-T細胞24h、48h凋亡率的改變。HMGN2-T細胞與轉(zhuǎn)染GV358空質(zhì)粒的Jurkat細胞相比較(7.02%VS3.57%,6.34%VS 0.84%),凋亡率分別增加3.45%和5.5%,有明顯差別(P=0.001),但HMGN2-T細胞在兩個時間點的凋亡情況(7.28%±0.99 VS 6.5%±0.72)無明顯改變(P=0.457)。6 HMGN2-T細胞在抗腫瘤過程中較多分泌TNF-α,IFN-γ,可以直接殺傷宮頸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌細胞,應(yīng)用ELISA法檢測HMGN2-T細胞分別與Hela細胞、LLC細胞、Hep G2細胞、MCF7細胞共培養(yǎng)過程中細胞因子IL-2,TNF-α,IFN-γ分泌情況。IL-2在Hela細胞、LLC細胞、Hep G2細胞、MCF7細胞中的分泌水平分別與對照組相比(2270.5±994.8 VS 1729±490.7,2997.5±1010.4 VS 2802.5±1115.1,3112.5±620.1VS 2371±677.4,3221.5±615.89 VS 3596.5±453.2)pg/ml沒有顯著性差異(P0.05);TNF-α分泌水平在LLC細胞(4332.5±887.4)pg/ml,MCF7細胞(3611.5±1511.0)pg/ml和Hep G2細胞(6256±660.4)pg/ml中分別與對照組相比(2167.5±498.5,1116±237.5,3556.5±1004.7)pg/ml有明顯增高,但在Hela細胞中(3002.5±306.1VS 2282±395.9)pg/ml變化水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異(P0.05);IFN-γ分別在LLC細胞、MCF7細胞、Hela細胞、Hep G2細胞中分泌水平與對照組相比較(18744.5±1545.0 VS 6781±1176.6,12852±3364.4 VS 4374±1347.7,15037.5±4850.0 VS 3348±750.9,14282.5±760.1 VS 7332.5±1921.2)pg/ml有顯著的增高,結(jié)果說明,HMGN2-T細胞對Hela細胞、LLC細胞、Hep G2細胞、MCF7細胞有明顯的殺傷作用,并且在殺傷過程中主要以分泌TNF-α,IFN-γ為主。LDH細胞毒實驗檢測HMGN2-T細胞與宮頸癌Hela細胞、肺癌LLC細胞、肝癌Hep G2細胞、乳腺癌MCF7細胞共培養(yǎng)過程中的殺傷作用。在LLC細胞,HMGN2-T細胞與對照組效靶比在1:1的殺傷率(5.62±1.45 VS 8.92±3.47)%無差異,從5:1、10:1、15:1、20:1開始,HMGN2-T細胞對LLC細胞特異性殺傷率(22.33±4.75 VS 3.95±6.73,23.60±6.58 VS 3.81±1.07,43.81±5.73 VS 5.27±0.90,55.34±3.45 VS 3.81±1.89)%與對照組相比有明顯差異,且隨著效靶比例增加,殺傷作用逐漸增強;效靶比從5:1起,在MCF7細胞的特異性殺傷率(18.23±3.47,32.67±7.44,58.78±16.51,66.74±8.38)%,Hela細胞的特異性殺傷率(13.29±5.45,21.89±5.54,47.74±4.04,57.81±3.37)%,Hep G2細胞的特異性殺傷率(19.58±5.22,29.57±10.17,56.22±10.26,64.18±25.30)%與對照組相比有明顯差異(P0.05),當效靶比增加到20:1時,HMGN2-T細胞分別對Hela細胞、LLC細胞、Hep G2細胞、MCF7細胞的特異性殺傷功能可達到55.4%、66.4%、57.8%、64.1%。結(jié)論HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ重組基因慢病毒載體感染Jurkat細胞可以制備HMGN2-T細胞。HMGN2-T細胞體外增殖作用顯著增加,可以直接殺傷宮頸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌細胞,有作為新型細胞免疫療法的臨床應(yīng)用潛力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.51

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7 聶進;結(jié)核感染T細胞斑點試驗在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用研究[D];遵義醫(yī)學院;2016年

8 馬俊;肝癌患者及健康人外周血Vγ9Vδ2 T細胞體外擴增前后亞型及免疫功能檢測[D];山西醫(yī)科大學;2016年

9 王靜靜;親緣HLA單倍體相合非體外去T細胞外周血造血干細胞移植治療成人急性淋巴細胞白血病療效分析[D];新疆醫(yī)科大學;2016年

10 談思怡;尼古丁對人Vγ9Vδ2-T細胞抗腫瘤活性的影響[D];暨南大學;2016年

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本文編號：1710671