本文選題：創(chuàng)傷性腦損傷　切入點：Lactadherin　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)的發(fā)病率、致殘率和致死率高,而且很難控制原發(fā)性損傷,因此控制TBI后的繼發(fā)性腦損傷成為提高患者預(yù)后的重要干預(yù)靶點。TBI后繼發(fā)的凝血功能障礙(traumatic brain injury-associated coagulopathy,TBI-AC)及過度免疫炎癥反應(yīng)是患者傷后致死致殘的重要原因,但目前機制尚不明確、臨床治療效果不佳。本課題組前期研究結(jié)果顯示,TBI后腦源性微粒(brain derived microparticles,BDMP)可大量釋放進(jìn)入循環(huán)血,通過激活凝血通路及血小板導(dǎo)致消耗性凝血功能障礙和出血。本次研究將在此基礎(chǔ)上,重點研究Lactadherin蛋白能否能增強并加速BDMP的清除,預(yù)防或減少TBI-AC的發(fā)生,改善TBI的預(yù)后及其機制。本研究將豐富對BDMP清除機制的研究,并為治療TBI-AC及TBI后繼發(fā)性損傷提供新方法。方法:(1)通過小鼠TBI模型,鼠尾靜脈注射Lactadherin觀察其是否能降低死亡率并改善TBI的預(yù)后。(2)通過伊文思藍(lán)染色觀察小鼠TBI模型鼠尾靜脈注射Lactadhein能否減少血腦屏障的滲漏。(3)通過磷鎢酸-蘇木精染色觀察小鼠肺組織的纖維素沉積(4)通過ELISA檢測血漿中D二聚體的含量變化及通過凝血因子Xa凝血時間實驗檢測Lactadhein能否減少TBI-AC的發(fā)生。(5)通過全血細(xì)胞計數(shù)研究TBI后血細(xì)胞含量的變化。(6)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測TBI后血漿中BDMP的含量變化。(7)通過ELISA檢測小鼠血漿內(nèi)Lactadherin蛋白在TBI前后的含量變化。(8)傷后給予Lactadherin蛋白研究使用Lactadherin蛋白治療的可行性。(9)注射生物素標(biāo)記的BDMP,并做組織病理染色,明確BDMP的清除途徑。(10)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測MP,Lactadherin及白細(xì)胞復(fù)合體的形成。(11)利用Lactadherin基因敲除小鼠及其同窩小鼠驗證實驗。(12)利用基因蛋白工程技術(shù)研究Lactadherin蛋白發(fā)揮作用的機制。(13)體外Transwell實驗檢測Lactadhein能否減少BDMP導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞間的滲漏。(14)體外流式細(xì)胞術(shù)驗證Lactadherin蛋白發(fā)揮作用的機制。(15)利用可視流式系統(tǒng)Amnis Image Stream X?Mk II觀察mt MP與單核細(xì)胞的結(jié)合,并嘗試阻斷其可能的結(jié)合位點。結(jié)果:(1)注射Lactadherin蛋白能減少TBI小鼠的死亡率,改善預(yù)后,降低血腦屏障滲漏,減少肺組織纖維素滲出。(2)體外Transwell實驗也證實Lactadherin蛋白能減少內(nèi)皮細(xì)胞間的滲漏(3)注射Lactadherin蛋白能減少TBI小鼠血漿中的BDMP含量,減少血小板的消耗,改善血液的高凝狀態(tài)。(4)ELISA結(jié)果顯示TBI后血漿中正常分泌的Lactadherin蛋白含量升高但不足以清除大量釋放的BDMP。(5)TBI后給予充足的Lactadherin蛋白能有效地幫助BDMP清除,改善小鼠預(yù)后。(6)生物素標(biāo)記的BDMP定位實驗顯示Lactadherin蛋白能增加BDMP在肝臟被巨噬細(xì)胞清除的量,同時體外實驗也能觀察到Lactadherin蛋白能促進(jìn)巨噬細(xì)胞粘附吞噬BDMP。(7)通過流式細(xì)胞術(shù)觀察到Lactadherin蛋白主要結(jié)合在BDMP的PS上(8)單純的Lactadherin蛋白的C1C2片段對BDMP的清除能力十分有限,提示Lactadherin蛋白上的EGF片段(該片段能與巨噬細(xì)胞上的αvβ3和αvβ5整合素受體結(jié)合)是不可缺少的部分。結(jié)論:(1)注射Lactadherin蛋白能通過降低血腦屏障滲漏、減少肺組織纖維素滲出、改善血液的高凝狀態(tài)等幾方面減少TBI小鼠的死亡率,改善預(yù)后(2)正常分泌的Lactadherin蛋白量較少不足以清除TBI后大量釋放的BDMP。(3)Lactadherin蛋白能有效地幫助BDMP與巨噬細(xì)胞結(jié)合促進(jìn)吞噬。(4)Lactadherin蛋白的C1C2片段能與BDMP上的PS相結(jié)合,EGF片段能與巨噬細(xì)胞上的αvβ3和αvβ5整合素結(jié)合,要充分的發(fā)揮清除作用二者缺一不可。本研究發(fā)現(xiàn)了Lactadherin蛋白能減少TBI小鼠的死亡率,改善預(yù)后,并揭示了Lactadherin蛋白清除BDMP的機制,為臨床治療TBI后的繼發(fā)性損傷提供了新的治療的方法和理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: traumatic brain injury (traumatic brain, injury, TBI) incidence rate, disability rate and death rate is high, and it is difficult to control the primary injury, so the control of secondary brain injury after TBI become the important target for intervention.TBI prognosis after coagulation dysfunction secondary to obstruction (traumatic brain injury-associated coagulopathy. TBI-AC) and excessive inflammatory reaction in patients with injury is important reason of death and disability, but the mechanism is not clear, clinical treatment is ineffective. Ourprevious studies showed that TBI brain derived microparticles (brain derived microparticles, BDMP) can be released into the blood circulation, through the activation of the coagulation pathway and lead to platelet consumption coagulation dysfunction and hemorrhage. This study will be based on this, focus on the study of Lactadherin protein can clear can enhance and accelerate the BDMP, prevent or reduce TBI-AC. Students, improve the prognosis and mechanism of TBI. This study will enrich the research on the BDMP removal mechanism, and provide new methods for the treatment of secondary injury after TBI-AC and TBI. Methods: (1) the mouse TBI model, rat tail vein injection of Lactadherin to observe whether it can reduce the mortality and improve the prognosis of TBI (2). Mice TBI model rat tail vein injection of Lactadhein can reduce the leakage of blood brain barrier by Evans blue staining. (3) observation of fibrin deposition in the lung tissue of mice by phosphotungstic acid hematoxylin staining (4) by changing the content of ELISA in plasma and D two dimers and the coagulation factor Xa clotting time assay can Lactadhein to reduce the incidence of TBI-AC. (5) the changes of blood cell content by blood cell count of TBI. (6) by flow cytometry content changes of BDMP in plasma after TBI. (7) detected by ELISA in mouse plasma Lactadh Erin protein content changes before and after TBI. (8) after injury to study the feasibility of the treatment of Lactadherin protein using Lactadherin protein. (9) injection of biotin labeled BDMP and histopathological staining, clear BDMP pathways. (10) detected by MP flow cytometry, the formation of Lactadherin and white blood cell complex. (11) knockout mice and littermate mice experiment using Lactadherin gene. (12) the use of gene engineering technology research of Lactadherin protein play a role in the mechanism. (13) in vitro Transwell assay can reduce Lactadhein leakage in BDMP induced endothelial cells. (14) in vitro flow cytometry verified Lactadherin proteins play a role in the mechanism. (15) the use of video streaming system Amnis Image Stream X? Mk II observation combined with MT MP and mononuclear cells, and try to block its possible binding sites. Results: (1) injection of Lactadherin eggs White can reduce the mortality of TBI mice, improve the prognosis, reduce the blood brain barrier leakage, reduce lung tissue fibrin exudation. (2) Transwell in vitro experiments also confirmed that Lactadherin protein can reduce the leakage between the endothelial cells (3) injection of Lactadherin protein can reduce the content of BDMP TBI in mouse plasma, platelet consumption, hypercoagulable state improve blood. (4) ELISA showed that Lactadherin protein content of normal secretion of TBI in plasma increased but not enough to clear the large release of BDMP. (5) TBI after given sufficient Lactadherin protein can effectively help eliminate BDMP, improve the prognosis of mice. (6) BDMP localization experiments of biotin labeled Lactadherin protein can display the increase of BDMP in the liver was removed and the amount of macrophages, in vitro can also be observed Lactadherin protein can promote the phagocytosis of macrophage adhesion BDMP. (7) Lactad was observed by flow cytometry The herin protein binding to BDMP PS (8) pure Lactadherin protein fragment C1C2 scavenging ability of BDMP is very limited, suggesting that Lactadherin protein on the EGF fragment (with the fragment with macrophages on alpha v beta 3 and alpha v beta 5 integrin receptor) is an indispensable part of the conclusion: (. 1) injection of Lactadherin protein by reducing blood brain barrier leakage, reduce lung tissue fibrin exudation, several aspects of improving blood hypercoagulability and reduce the mortality of TBI mice, improve the prognosis of Lactadherin (2) protein less normal secretion is insufficient to remove TBI after the release of BDMP. (3) Lactadherin protein can effectively help BDMP and macrophage phagocytosis. Combined with the promotion of (4) Lactadherin protein fragment C1C2 can combine with BDMP PS, with EGF fragment and macrophages on alpha v beta 3 and alpha v beta 5 integrin, to fully play the role of the two clear It is indispensable. This study found that Lactadherin protein can reduce the mortality and prognosis of TBI mice, and reveal the mechanism of Lactadherin protein clearance BDMP. It provides a new therapeutic method and theoretical basis for clinical treatment of secondary injury after TBI.

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R651.15

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