本文選題：Proneurotensin　切入點(diǎn)：Clusterin　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：第一部分血清脂肪細(xì)胞因子Proneurotensin、Clusterin與肥胖及早發(fā)冠心病的相關(guān)性研究目的:冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(Coronary artery disease,CAD)(冠心病)是危害人類健康的慢性病之首。因冠心病所致死亡人數(shù)及患病人數(shù)較多,且呈逐年上升趨勢(shì),因此對(duì)人類的健康構(gòu)成了極大的威脅。隨著近年來我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,人們飲食結(jié)構(gòu)、缺乏鍛煉等生活方式的變化,冠心病患者日漸呈年輕化發(fā)展。男性小于55歲,女性小于65歲診斷為冠心病,稱其為早發(fā)冠心病(premature coronary artery disease,PCAD)。鑒于發(fā)病較早,遠(yuǎn)期預(yù)后較差,相關(guān)研究較少,因此本研究著眼于早發(fā)冠心病相關(guān)研究。既往研究發(fā)現(xiàn)肥胖與冠心病密切相關(guān),脂肪細(xì)胞因子在其中起重要作用。Proneurotensin(前神經(jīng)降壓素,PNT)及clusterin(簇集蛋白,CLU)為兩種與肥胖密切相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子,但其與早發(fā)冠心病關(guān)系尚未見報(bào)道,因此本研究就脂肪細(xì)胞因子proneurotensin及clusterin與早發(fā)冠心病相關(guān)性進(jìn)行探究。方法:回顧性分析2011年11月至2016年4月于北京協(xié)和醫(yī)院行冠脈造影術(shù)患者3364名,從中篩選男性55歲、女性65歲、任一支冠脈狹窄50%符合早發(fā)冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)患者359名。根據(jù)年齡、性別、BMI匹配,選取男性55歲,女性65歲,冠脈造影任何一支均50%,符合非早發(fā)冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)139名;另選取2009年至2012年于北京協(xié)和醫(yī)院行體檢,否認(rèn)既往冠心病、高血壓、糖尿病及高脂血癥等慢性病史體檢受試者(共193名),作為體檢對(duì)照組。收集上述691名受試者血常規(guī)、肝腎功、血脂、空腹血糖等臨床資料,應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)血清proneurotensin、clusterin水平,進(jìn)行相關(guān)性及線性回歸分析。結(jié)果:(1)早發(fā)冠心病患者肥胖/超重比例高:359名早發(fā)冠心病者中,22.0%(79/359)為肥胖,42.1%(151/359)為超重,34.5%(124/359)為正常,1.4%(5/359)為偏瘦。因此早發(fā)冠心病超重及肥胖所占比例為64.1%(230/359),明顯高于我國(guó)肥胖/超重指南報(bào)道肥胖/超重患病比例29.9%。(2)血清proneurotensin、clusterin在肥胖、超重及體重正常個(gè)體中的變化:肥胖組proneurotensin水平較超重及正常組顯著增高[肥胖35.27(8.42,108.12)vs.超重11.52(7.85,85.34)vs.正常 9.14(7.79.74.51),p0.05]。肥胖組 clusterin 水平較超重及正常組升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[肥胖84.15(34.05,141.96)vs.超重44.87(30.74,147.77)vs.正常 47.86(31.77,156.22),p0.05]。(3)血清proneurotensin及clusterin在體檢對(duì)照組、非早發(fā)冠心病、早發(fā)冠心病組中遞增:血清proneurotensin于體檢對(duì)照、非早發(fā)冠心病、早發(fā)冠心病組逐組升高[PE 9.05(8.53-54.52)vs.NPCAD 12.90(7.49-98.89)vs.PCAD 14.60(7.83-105.89),p0.05]。血清clusterin于體檢對(duì)照、非早發(fā)冠心病、早發(fā)冠心病組呈上升趨勢(shì)[PE 40.64(28.00-135.91)vs.NPCAD 54.56(31.13-147.92),p0.05;NPCAD 54.56(31.13-147.92)vs.PCAD 70.25(33.40-162.07),p=0.07]。(4)血清proneurotensin影響因素的多元線性回歸分析:血清proneurotensin與女性(r=0.12)、實(shí)驗(yàn)分組(PE/NPCAD/PCAD)(r=0.12)、BMI(r=0.10)、總膽固醇(r=0.16)、HDL-C(r=0.09)呈正相關(guān),與LDL-C(r=-0.15)呈負(fù)相關(guān)(p均0.05)。多元線性逐步回歸分析發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)分組(β=0.30,p0.05)及BMI分組(β=0.14,p0.05)進(jìn)入方程,表明proneurotensin與早發(fā)冠心病及BMI獨(dú)立正相關(guān),R2=0.346,矯正決定系數(shù)R2=0.121。(5)血清clusterin影響因素的多元線性回歸分析:血清clusterin與女性(r=0.13)、實(shí)驗(yàn)分組(PE/NPCAD/PCAD)(r=0.13)呈正相關(guān),與總膽固醇(r=-0.12)、LDL-C(r=-0.19)呈負(fù)相關(guān)(p均0.05)。進(jìn)行多元線性逐步回歸分析,實(shí)驗(yàn)分組(β=0.33,p0.05)及總膽固醇(β=-0.13,p0.05)進(jìn)入方程,表明血清clusterin與早發(fā)冠心病呈正相關(guān),與總膽固醇呈負(fù)相關(guān),R2=0.393,矯正決定系數(shù)R2=0.145。(6)早發(fā)冠心病組血清proneurotensin、clusterin相關(guān)性分析:早發(fā)冠心病組,proneurotensin與糖尿病(r=0.18)、高脂血癥(r=0.13)呈正相關(guān)(p均0.05);血清clusterin與高脂血癥(r=0.11)呈正相關(guān);服用他汀可降低兩者血清水平(r=-0.23及-0.20,均0.05)。結(jié)論:1.血清proneurotensin水平于早發(fā)冠心病及肥胖狀態(tài)顯著升高,與早發(fā)冠心病及BMI正相關(guān),提示proneurotensin可能為肥胖與早發(fā)冠心病的橋接因素。2.血清clusterin水平于早發(fā)冠心病及肥胖狀態(tài)升高,與早發(fā)冠心病正相關(guān),與總膽固醇負(fù)相關(guān),提示clusterin可能通過負(fù)向調(diào)控膽固醇,影響冠心病的發(fā)生發(fā)展。第二部分Neurotensin、Clusterin于炎癥狀態(tài)脂肪細(xì)胞中表達(dá)情況及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響目的:目前認(rèn)為肥胖是一種慢性炎癥反應(yīng)綜合征,脂肪細(xì)胞及其相關(guān)因子共同組成一個(gè)促炎環(huán)境,通過影響機(jī)體免疫、內(nèi)分泌、糖脂代謝及循環(huán)功能等影響機(jī)體代謝與循環(huán)系統(tǒng)。脂肪細(xì)胞因子不僅可以通過影響傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,還可以作用于血管壁組織,影響血管內(nèi)皮功能、改變平滑肌細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)單核/巨噬細(xì)胞黏附活性等多環(huán)節(jié)共同影響動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。本研究擬應(yīng)用不同濃度脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用于3T3-L1誘導(dǎo)分化脂肪細(xì)胞及人脂肪細(xì)胞,模擬肥胖脂肪細(xì)胞低度炎癥狀態(tài),進(jìn)而分析其炎癥相關(guān)脂肪細(xì)胞因子(neurotensin、clusterin、IL6、TNFα)表達(dá)水平變化。同時(shí)應(yīng)用人 neurotensin、clusterin及LPS作用于內(nèi)皮細(xì)胞,分析其對(duì)內(nèi)皮黏附、趨化及炎性因子表達(dá)影響。方法:(1)①應(yīng)用含有胰島素(100μg/ml)、地塞米松(10uM),IBMX(0.5mM)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液,作用于接觸抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞3天,改用僅含胰島素(100μg/ml)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液4天,于第8天分別應(yīng)用1、2、5μg/mlLPS作用于脂肪細(xì)胞24h。②應(yīng)用含有1×10-6mol/L地塞米松、50μg/ml抗壞血酸及100μg/ml IBMX誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液,作用于人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,誘導(dǎo)分化12天為成熟脂肪細(xì)胞,加入1、2、5μg/mlLPS作用于脂肪細(xì)胞24h。分別提取上述細(xì)胞總mRNA,應(yīng)用RT-qPCR方法檢測(cè)neurotensin、clusterin、IL-6及TNF-α表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)三孔重復(fù)。(2)分別應(yīng)用人 200μg/ml neurotensin、5μg/ml clusterin、1μg/ml LPS 作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)24小時(shí)后,提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用RT-qPCR方法檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TNFα、IL-10mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)三孔重復(fù)。結(jié)果:(1)不同濃度LPS作用于3T3-L1誘導(dǎo)分化脂肪細(xì)胞,對(duì)neurotensin、clusterin、IL-6、TNFα表達(dá)的影響①neurotensin mRNA表達(dá)水平與LPS呈劑量依賴性增高關(guān)系,分別為對(duì)照組1.75±0.16 倍(p0.01,1μg/ml 組),2.41±0.28 倍(p0.01,2μg/ml 組),5.32±0.33倍(p0.01,5μg/ml組)。提示neurotensin隨脂肪細(xì)胞致炎嚴(yán)重程度逐漸升高。②clusterin mRNA表達(dá)于不同LPS組較對(duì)照組表達(dá)水平顯著上升,分別為對(duì)照組2.16±0.06 倍(p0.01,1μg/ml 組),2.14±0.04 倍(p0.01,2μg/ml 組),1.77±0.09倍(p0.01,5μg/ml組)。提示clusterin于脂肪細(xì)胞炎癥狀態(tài)表達(dá)有所上升。③IL-6 mRNA表達(dá)水平于不同濃度LPS組均較對(duì)照組表達(dá)水平均顯著增高,分別為對(duì)照組4.99±0.29倍(p0.01,1μg/ml),4.16±0.07(p0.01,2μg/ml),4.78±0.24(p0.01,5μg/ml)。表明LPS對(duì)于脂肪細(xì)胞致炎模型構(gòu)建成功。④TNFα mRNA表達(dá)水平于不同濃度LPS組較對(duì)照組表達(dá)水平呈上升趨勢(shì),分別為對(duì)照組 2.26±0.12 倍(p0.01,1μg/ml),1.98±0.12(p0.05,2μg/ml),1.51±0.04(p0.05,5 μg/ml),表明LPS對(duì)于脂肪細(xì)胞致炎模型構(gòu)建成功。(2)不同濃度LPS作用于人脂肪細(xì)胞,對(duì)neurotensin、clusterin、IL-6、TNFα表達(dá)的影響①neurotensin mRNA表達(dá)水平于不同濃度LPS作用下均增高,分別為對(duì)照組6.17±0.58 倍(p0.01,1μg/ml 組),5.02±0.60 倍(p0.01,2μg/ml 組),5.34±0.84倍(p0.01,5μg/ml組)。提示neurotensin于脂肪細(xì)胞炎癥狀態(tài)升高。②clusterin mRNA表達(dá)水平于不同濃度LPS組與對(duì)照組表達(dá)水平相近,分別為對(duì)照組 1.10±0.15(p0.05,1μg/ml 組),0.91±0.13 倍(p0.05,2μg/ml 組),0.91±0.06倍(p0.05,5μg/ml組)。提示clusterin于炎癥狀態(tài)表達(dá)無明顯改變。③IL-6 mRNA表達(dá)水平于不同濃度LPS組均較對(duì)照組表達(dá)水平顯著增高,分別為對(duì)照組 5.52±0.45 倍(p0.01,1μg/ml 組),5.58±0.57(p0.01,2μg/ml 組),3.64±0.53(p0.01,5μg/ml組)。表明LPS對(duì)于脂肪細(xì)胞致炎模型構(gòu)建成功。④TNFα mRNA表達(dá)水平于不同濃度LPS組均與對(duì)照組無明顯差異。(3)LPS、neurotensin及clusterin(human)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附、趨化及炎性因子表達(dá)的影響①1μg/ml LPS組干預(yù)HUVEC黏附、炎性及趨化因子表達(dá)水平顯著增高。ICAM-1(為對(duì)照組 18.01±1.60 倍,p0.01)、VCAM-1(為對(duì)照組 10.11±1.17 倍,p0.01)、IL-6(為對(duì)照組 24.61±2.22 倍,p0.01)、TNFα(為對(duì)照組 20.83±2.47 倍,p0.01)、MCP-1(為對(duì)照組14.80±1.49倍,p0.01)mRNA相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組顯著升高,表明LPS作用HUVEC炎癥狀態(tài)模擬成功。②200μg/ml neurotensin干預(yù)HUVEC黏附、炎性及趨化因子表達(dá)水平均顯著下降。VCAM-1(為對(duì)照組 0.56±0.07 倍,p0.01)、IL-6(為對(duì)照組 0.62±0.05 倍,p0.01)、TNFα(為對(duì)照組 0.55±0.12 倍,p0.01)、MCP-1(為對(duì)照組 0.45±0.04 倍,p0.01)mRNA水平均較對(duì)照組顯著下降。③5μg/ml clusterin干預(yù)HUVEC炎性及趨化因子表達(dá)水平顯著下降。IL-6(為對(duì)照組 0.77±0.05 倍,p0.05)、TNFα(為對(duì)照組 0.55±0.12 倍,p0.01)、MCP-1(為對(duì)照組0.52±0.03倍,p0.01)mRNA水平較對(duì)照組顯著下降。但對(duì)于ICAM-1及VCAM-1等黏附因子,無顯著影響。結(jié)論:1.不同濃度LPS作用于3T3-L1誘導(dǎo)分化脂肪細(xì)胞及人脂肪細(xì)胞,neurotensin及IL-6 mRNA水平表達(dá)均上調(diào),提示neurotensin在脂肪細(xì)胞處于炎癥狀態(tài)時(shí)表達(dá)增加。2.不同濃度LPS作用于3T3-L1誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞clusterin表達(dá)均上調(diào),于人脂肪細(xì)胞clusterin表達(dá)無上調(diào),提示clusterin于不同脂肪細(xì)胞表達(dá)不一。3.5μg/ml clusterin及200μg/ml neurotensin使內(nèi)皮細(xì)胞趨化、炎癥因子表達(dá)顯著下降,且neurotensin影響?zhàn)じ揭蜃拥谋磉_(dá),進(jìn)而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起一定的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R541.4;R589.2

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8 趙水平;林e，

本文編號(hào)：1697451