本文選題：肥胖　切入點：糖尿病　出處：《浙江大學》2017年博士論文

【摘要】：肥胖是目前發(fā)達國家和發(fā)展中國家共同面臨的全球性公共衛(wèi)生難題。內(nèi)臟脂肪的堆積會導致代謝性疾病,包括心血管疾病和Ⅱ型糖尿病等。胰島素抵抗是2型糖尿病和多種心血管疾病的共同發(fā)病機制。胰島素抵抗是指細胞或組織對正常劑量的胰島素反應性下降。引起胰島素抵抗的原因有很多,包括肥胖相關的慢性炎癥狀態(tài)、脂代謝異常、腸道菌群失調(diào)等。對胰島素信號通路的研究已經(jīng)有很多,而最近又有新的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳學修飾在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中也起著重要的作用。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的RNA,且大部分lncRNA幾乎無編碼蛋白質(zhì)功能。所以最初這些RNA分子被認為沒有生物學活性。但現(xiàn)在越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在許多生物學過程中起著作用,包括遺傳學印記、轉(zhuǎn)錄激活、RNA剪切、核內(nèi)運輸?shù)取ncRNA也能參與脂肪的形成與分化,有研究發(fā)現(xiàn),某些lncRNA能與過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)結(jié)合參與調(diào)控脂肪的分化、生成。PPARγ的表達能影響抵抗素和一些促炎細胞因子的產(chǎn)生,從而與胰島素抵抗相關。所以我們猜測lncRNA可能也參與調(diào)控了脂肪組織發(fā)生胰島素抵抗的這一病理過程。在本研究中,我們通過高脂喂養(yǎng)C57BL6小鼠12周來誘導產(chǎn)生胰島素抵抗模型,在鑒定模型建立成功后,將小鼠附睪脂肪組織送第二代高通量測序,了解lncRNA在正常小鼠附睪脂肪組織以及發(fā)生胰島素抵抗的脂肪組織中表達差異情況,從而篩選出對胰島素抵抗可能有影響的lncRNA。隨后,將小鼠3T3-L1前脂肪細胞誘導為成熟脂肪細胞,通過基因干擾技術體外沉默胰島素抵抗脂肪組織中過表達的lncRNA,觀察其對脂肪細胞胰島素敏感性的影響。第一部分長鏈非編碼RNA在小鼠脂肪組織胰島素抵抗中的表達譜特征目的研究lncRNAs在小鼠正常和發(fā)生胰島素抵抗的附睪脂肪組織中表達譜的差異特征。篩選與胰島素抵抗相關的lncRNAs,為后續(xù)的研究提供基礎。方法將20只5周齡健康雄性C57BL6小鼠適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為正常飲食組(NCD 10只/組)和高脂飲食組(HFD 10只/組)。NCD組用普通標準飼料(10%脂肪)喂養(yǎng),HFD組用高脂飼料(60%脂肪)喂食12周來建立胰島素抵抗模型。隨后通過口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)和胰島素耐量試驗(ITT)來評估胰島素抵抗模型是否成功。測量比較兩組小鼠的體重、附睪脂肪重量。蘇木精-伊紅(HE)染色觀察附睪脂肪細胞面積。Real-time PCR檢測小鼠脂肪組織炎癥指標白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA表達。Western blotting檢測脂肪細胞p-Akt(S473)和Akt蛋白表達。第二代高通量測序檢測兩組小鼠附睪脂肪組織中l(wèi)ncRNA的表達情況,并選擇表達差異在3倍以上的lncRNA行Real-time PCR驗證。對差異表達的lncRNA進行GO分析和KEGG通路分析。結(jié)果與NCD組比較,HFD組小鼠體重及附睪脂肪重量明顯增加(P0.01),附睪脂肪細胞面積顯著增加,糖耐量異常和胰島素抵抗明顯。Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn),HFD組附睪脂肪組織中IL-6和TNF-α表達顯著高于NCD組(P0.01)。二代高通量測序發(fā)現(xiàn),與NCD組比較,HFD組附睪脂肪組織中有71條lncRNA和2985條mRNA表達顯著增高(P0.05);有145條lncRNA和2472條mRNA表達顯著下降(P0.05)。Real-time PCR表達差異在3倍以上的lncRNA共15條,其表達趨勢與高通量測序結(jié)果基本一致。GO分析結(jié)果提示差異表達的lncRNA主要涉及膜結(jié)合的細胞組分、蛋白綁定、催化酶的活性、細胞內(nèi)各種化合物以及核酸的代謝過程等,KEGG通路分析結(jié)果提示差異表達的lncRNA參與的信號通路主要涉及酒精中毒、免疫炎癥、癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、以及代謝途徑等,與胰島素抵抗相關。結(jié)論高脂飲食可使得C57BL6小鼠發(fā)生胰島素抵抗。長鏈非編碼RNA表達譜在小鼠正常白色脂肪組織和發(fā)生胰島素抵抗的白色脂肪組織中表達差異顯著,提示lncRNA可能在脂肪組織胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。第二部分LncRNA對小鼠脂肪細胞胰島素敏感性的影響目的探討根據(jù)第一部分篩選出的上調(diào)的lncRNAs在小鼠3T3-L1誘導分化的成熟脂肪細胞以及發(fā)生胰島素抵抗的脂肪細胞中的表達差異情況,并觀察其對葡萄糖攝取率、PPARγ、GLUT4、IL-6的mRNA表達和Akt蛋白及其磷酸化水平的影響方法通過1mg/ml胰島素、10mmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)將小鼠3T3-L1細胞誘導分化為成熟的脂肪細胞。油紅O染色以及Real-time PCR檢測脂肪細胞形成標志基因Fabp4和PPARy的表達情況,鑒定是否為成熟脂肪細胞。采用4000μmol/L棕櫚酸(PA)刺激48小時建立細胞胰島素抵抗模型。葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法比較正常對照組(CON)和棕櫚酸刺激組(PA)葡萄糖的濃度并計算各組的葡萄糖攝取率,Real-timePCR檢測兩組脂肪細胞PPARγ、GLUT4、IL-6 mRNA的表達,Western blotting檢測各組脂肪細胞Akt蛋白及其磷酸化水平。Real-time PCR檢測根據(jù)第一部分實驗結(jié)果篩選出的lncRNA在普通培養(yǎng)的脂肪細胞(CON組)和發(fā)生胰島素抵抗的脂肪細胞(PA組)中的表達情況。根據(jù)Real-time PCR結(jié)果,選擇在兩組間表達差異明顯的lncRNA,使用RNA干擾技術沉默相關lncRNA(siRNA組),選擇與目的基因序列無同源性的siRNA作為陰性對照(NC組)。根據(jù)是否加棕櫚酸將細胞分為以下四組,NC組,siRNA組,NC+PA組,siRNA+PA組,計算各組的葡萄糖攝取率,各組脂肪細胞PPARγ、GLUT4、IL-6 mRNA的表達和Akt蛋白及其磷酸化水平。結(jié)果小鼠3T3-L1前脂肪細胞經(jīng)誘導分化為成熟脂肪細胞,油紅O染色后于光鏡下可見分化成熟的脂肪細胞內(nèi)的脂滴被染成橘紅色,Real-time PCR顯示Fabp4和PPARy的mRNA水平顯著增加。PA刺激后,脂肪細胞的葡萄糖攝取率下降,PPARγ、GLUT4 mRNA表達減少,IL-6 mRNA表達升高,Akt的磷酸化水平下降。在第一部分中篩選出來的15條上調(diào)的lncRNA中,有9條在體外培養(yǎng)的脂肪細胞中也存在PA組表達顯著高于CON組的情況。通過對其中3條候選的lncRNA(Gm26870、Gpr137b-ps、TCONS_01864186)進行功能缺失性研究發(fā)現(xiàn),用siRNA沉默Gm26870的表達能緩解PA引起的葡萄糖攝取率下降,并改善胰島素抵抗引起的PPARγ、GLUT4mRNA表達抑制和pAkt/Akt比值下降,減輕IL-6 mRNA的升高。結(jié)論PA能引起小鼠脂肪細胞的胰島素抵抗,lncRNA Gm26870可能具有調(diào)節(jié)胰島素敏感性的作用。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R589.2

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本文編號：1694470