發(fā)布時(shí)間：2018-03-31 11:16

  本文選題：前列腺癌　切入點(diǎn)：FKBP51　出處：《蘭州大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:前列腺癌(PCa)是男性癌癥最常見的惡性腫瘤之一。對(duì)于晚期患者除了手術(shù)治療以外,常常使用抗雄藥物作為輔助治療。這些抗雄藥物多是靶向于雄激素受體(AR),競(jìng)爭(zhēng)性地與雄激素結(jié)合在活性位點(diǎn),阻礙AR信號(hào)通路并且抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),但這些藥物的治療效果卻未令人滿意。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展,腫瘤的藥物開發(fā)越來越多依賴關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)構(gòu),成為腫瘤藥物開發(fā)的主要方法。有研究報(bào)道在前列腺癌細(xì)胞中,FKBP51是AR的正調(diào)控因子,通過抑制FKBP51的活性能夠有效抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性,降低AR的信號(hào)通路。本課題以FKBP51為主要靶點(diǎn),通過虛擬方法篩選方法,篩選出小分子抑制劑,抑制PCa細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí),前人報(bào)道小分子-對(duì)硝基酚(環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)具有抗雄活性,它的抗雄機(jī)制是復(fù)雜的,可能涉及了AR信號(hào)通路多個(gè)成分,但它是怎樣抑制AR活性的并不知道。另外,雷帕霉素(rapamycin)是FKBP51已知的小分子抑制劑,但它對(duì)AR信號(hào)通路的影響是未知的,因此,我們研究是否它對(duì)AR信號(hào)通路的作用,以及是否通過FKBP51蛋白介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)將FKBP51作為篩藥的靶向蛋白和分子抗雄作用的關(guān)鍵蛋白,旨在研究FKBP51在前列腺癌信號(hào)通路中的作用,并進(jìn)一步探討小分子藥物或者污染物通過FKBP51作用的可能的抗雄機(jī)制,為PCa及CRPC的治療提供一種新的治療策略,尤其對(duì)于雄激素抵抗型前列腺癌的藥物設(shè)計(jì)及臨床治療提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:計(jì)算機(jī)虛擬篩選靶向FKBP51的小分子抑制劑,根據(jù)打分選擇前140名的虛擬篩選小分子抑制劑;構(gòu)建FK1-PET-28a質(zhì)粒,通過大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)并純化FKBP51的FK1區(qū)域;通過蛋白質(zhì)熒光淬滅實(shí)驗(yàn)-酶標(biāo)法高通量檢測(cè)蛋白質(zhì)與虛擬篩選小分子的相互作用,并用熒光滴定法測(cè)結(jié)合較好的小分子的結(jié)合常數(shù)。不同溫度下通過蛋白質(zhì)熒光淬滅實(shí)驗(yàn)-分光光度法檢測(cè)小分子(對(duì)硝基酚、rapamycin)與FKBP51的相互作用;將小分子與蛋白質(zhì)共結(jié)晶,通過分子結(jié)構(gòu)學(xué)方法X-晶體衍射分析小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合復(fù)合物的結(jié)構(gòu),分析它們結(jié)合的特征等;通過分子動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)分子小分子與蛋白結(jié)合的復(fù)合物的穩(wěn)定性;采用MTT比色法檢測(cè)小分子對(duì)前列腺細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的影響;利用qRT-PCR檢測(cè)小分子對(duì)AR所調(diào)控的下游基因mRNA水平的影響;通過Western blot檢測(cè)小分子對(duì)AR、FKBP51與PSA蛋白的表達(dá)水平的影響。結(jié)果:(1)誘導(dǎo)和純化FK1區(qū)域,純化后鑒定純度超過99%。(2)對(duì)硝基酚(PNP)能夠與FKBP51的FK1區(qū)域相互作用,隨著PNP滴定濃度的增加,蛋白的熒光強(qiáng)度減弱;隨著溫度的增加,它們的結(jié)合增強(qiáng),在人體生理溫度下(310k)它們的結(jié)合力最強(qiáng)。(3)X-晶體衍射分析FK1與PNP結(jié)合的復(fù)合物的結(jié)構(gòu),PNP占據(jù)了FK1區(qū)域的活性位點(diǎn),與未結(jié)合小分子的蛋白相比,復(fù)合物結(jié)構(gòu)更加堅(jiān)固。(4)分子動(dòng)力學(xué)揭示了FK1與PNP的結(jié)合非常穩(wěn)定。(5)計(jì)算FK1區(qū)域與PNP的結(jié)合自由能得出小分子與蛋白主要通過非極性鍵相互作用。(6)計(jì)算與PNP結(jié)合的FK1區(qū)域的每個(gè)熱點(diǎn)氨基酸的結(jié)合自由能,顯示出與X-晶體衍射結(jié)構(gòu)分析一致的熱點(diǎn)氨基酸。(7)不同濃度的PNP在48小時(shí)抑制了前列腺癌LNCaP和22Rv1細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。(8)PNP抑制了AR所調(diào)控的下游基因(PSA,KLK2,S100P,TMPRSS2)的mRNA水平的表達(dá),從而抑制了AR信號(hào)通路。(9)計(jì)算機(jī)虛擬篩選得到FKBP51小分子抑制劑,前140名能夠與FKBP51蛋白相互作用。(10)得到結(jié)合較強(qiáng)的前10個(gè)虛擬篩選小分子的解離常數(shù),其中四個(gè)小分子的Kd值小于20μM。(11)虛擬篩選小分子能夠抑制LNCaP細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。(12)不同濃度的Rapamycin在24小時(shí)和48小時(shí)抑制了前列腺癌LNCaP細(xì)胞和22rv1細(xì)胞生長(zhǎng)。(13)Rapamycin能夠與FKBP51相互作用。(14)X-晶體衍射分析FK1與rapamycin結(jié)合的復(fù)合物的結(jié)構(gòu),rapamycin占據(jù)了FK1區(qū)域的活性口袋結(jié)構(gòu)。(14)Rapamycin能夠抑制AR調(diào)控的下游基因mRNA的表達(dá)。(5)Rapamycin抑制了AR調(diào)控的下游基因PSA蛋白水平的表達(dá)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了PNP能夠與FKBP51蛋白結(jié)合及PNP在前列腺癌細(xì)胞的抗雄機(jī)理,即PNP抑制AR的信號(hào)通路可能通過與FKBP51相互作用,抑制其活性進(jìn)而抑制了AR的活性,降低AR下游基因的表達(dá),抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外,我們運(yùn)用虛擬篩選方法,以FKBP51為靶點(diǎn),得到了一些有效抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的小分子,并且在分子水平上驗(yàn)證了與FKBP51的相互作用。同時(shí),作為FKBP51的抑制劑rapamycin,我們通過X-晶體衍射揭示了rapamycin與FKBP51的結(jié)合方式,同時(shí)證明了rapamycin能夠降低AR的信號(hào)通路,抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[Abstract]:Objective: prostate cancer (PCa) is one of the most common malignant tumor in male cancer. For patients with advanced surgical treatment in addition to outside, often using anti drugs as adjuvant therapy. These male male anti drug is targeting androgen receptor (AR), competing with androgen binding in the active site, and inhibition of prostate cancer cell block AR signaling in growth, but the therapeutic effect of these drugs are not satisfactory. With the development of structural biology, drug development and tumor structure more dependent critical target protein, has become the main method of tumor drug development. Studies have reported in prostate cancer cells, FKBP51 is a positive regulator of AR transcription. The activity by inhibiting the activity of FKBP51 can effectively inhibit AR, reduce the AR signaling pathway. This paper takes FKBP51 as the main target, through the method of virtual screening method, screening of small molecule inhibitors, Inhibit the growth of PCa cells. At the same time, previous reports of small molecule - nitrophenol (EDCs) with anti male activity, its anti male mechanism is complex and may involve multiple components of the AR pathway, but it is how to inhibit the activity of AR does not know. In addition, Lei rapamycin (rapamycin) is a small molecule inhibitor FKBP51 is known, but its effect on the AR signaling pathway is unknown, therefore, we investigated whether its effect on the AR signaling pathway, and whether it is mediated by FKBP51 protein. The key protein FKBP51 as a drug screening target anti male role to proteins and molecules, to effect study of FKBP51 signaling pathway in prostate cancer, and further explore the small molecule drugs or contaminants through the mechanism of anti male possible role of FKBP51, and provides a new therapeutic strategy for the treatment of PCa and CRPC, especially for male steroid resistance To provide a theoretical basis and experimental basis for prostate cancer drug design and clinical treatment. Methods: virtual screening targeted small molecule inhibitors of FKBP51, according to the choice of scoring virtual screening of small molecule inhibitors of the top 140; the construction of FK1-PET-28a plasmid, FK1 region by Escherichia coli expression and purification of FKBP51 by protein interaction; fluorescence quenching experiments - ELISA high-throughput protein detection and virtual screening of small molecules, and fluorescence titration with the binding constants of small molecule better. Under different temperatures through the protein fluorescence quenching experiment - spectrophotometric detection of small molecules (rapamycin p-nitrophenol,) the interaction with FKBP51 the small molecules and proteins; CO crystallization by molecular structure method of X- crystal diffraction analysis of small molecules and protein structure with complex analysis, they combine the characteristics of The stability of the complexes; by combining molecular detection method of molecular dynamics of small molecules and proteins; by MTT colorimetric detection of small molecule effects on growth and proliferation of prostate cells; effect of downstream gene mRNA level using the qRT-PCR detection of small molecular regulation of AR; through Western blot detection of small molecules on AR expression the level of FKBP51 and PSA protein. Results: (1) induction and purification of the FK1 region, after purification. The purity of more than 99%. (2) p-nitrophenol (PNP) can interact with the FKBP51 FK1 region, with the increase of PNP titration concentration, the fluorescence intensity of the protein decreased; with the increase of temperature, enhance their in combination, human physiological temperature (310K) combined with the strongest of them. (3) X- crystal diffraction analysis of FK1 and PNP combined with the structure of the complexes, PNP occupy the active sites in FK1 region, compared with the combination of small molecule protein composite The structure is more solid. (4) molecular dynamics reveals the combination of FK1 and PNP are very stable. (5) can be obtained free of small molecules and protein mainly through non polar bond interaction with the calculated FK1 region and PNP. (6) binding free energy of each hot spot calculation of FK1 and PNP combined with the amino acid region of the show, and X- crystal diffraction structure analysis of hot amino acids identical. (7) different concentrations of PNP inhibited the growth and proliferation of LNCaP cells and 22Rv1 prostate cancer in 48 hours. (8) PNP inhibits downstream genes regulated by AR (PSA, KLK2, S100P, TMPRSS2) expression level of mRNA. To inhibit the pathway of AR. (9) computer virtual screening by small molecule inhibitors of FKBP51, to the top 140 and FKBP51 protein interaction. (10) obtained with dissociation constants of 10 before the virtual screening of small molecule strong, including four small molecular Kd value of less than 20 M. (11) deficiency The growth and proliferation of quasi screening of small molecules could inhibit LNCaP cells. (12) different concentrations of Rapamycin in 24 hours and 48 hours inhibits prostate cancer LNCaP cells and 22Rv1 cells. (13) Rapamycin can interact with FKBP51. (14) X- crystal diffraction analysis of FK1 and rapamycin combined with the structure of the complex rapamycin occupied the active pocket structure of the FK1 region. (14) the expression of downstream genes mRNA Rapamycin can inhibit the regulation of AR. (5) Rapamycin inhibited the expression of downstream genes PSA protein level in the regulation of AR. Conclusion: This study found that PNP can combine with FKBP51 protein and PNP in the mechanism of anti male prostate cancer cells that is, the inhibition of PNP signaling pathway of AR may interact with FKBP51 and inhibit its activity and inhibit the activity of AR, reduce the expression of downstream genes of AR, inhibit the growth of prostate cancer cells. In addition, we use virtual screening Methods FKBP51 as a target to get some effective to inhibit the growth of prostate cancer cells of small molecules, and verify the interaction with FKBP51 at the molecular level. At the same time, as the FKBP51 inhibitor rapamycin, we reveal the combination of rapamycin and FKBP51 by X- crystal diffraction, and proves that rapamycin can reduce the signal pathway AR, inhibit the growth of prostate cancer cells.

【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：1690494