發(fā)布時間：2018-03-30 11:56

  本文選題：mi　切入點：R-146b　出處：《第三軍醫(yī)大學》2015年博士論文

【摘要】：研究背景20世紀以來,隨著篩查和治療技術的進步,先心病的治愈率顯著提升,但是復雜型先心病死亡率仍然很高。紫紺型先心病是較為常見的復雜型先心病。在紫紺型先心病中,心臟血流由右向左分流導致的慢性缺氧是此類先心病共有的病理生理過程。雖然紫紺型先心病的患者長期處于慢性缺氧狀態(tài),但他們大多數人能耐受這種缺氧存活,直至合適的手術時期。已有的研究證實,心肌慢性缺氧適應性改變能增強心肌細胞對多種外界刺激的耐受,但這其中的機制并未完全闡明。因此,研究慢性缺氧條件下心肌細胞的適應機制可能為改善臨床治療效果,降低缺氧性心臟病的死亡率做出貢獻。MicroRNAs(miRNAs)是內源性,短鏈單鏈非編碼RNA。mi RNA基因以單拷貝,多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中,mi RNA與靶mRNA配對,通過形成誘導沉默復合體(miRISC),抑制mRNA翻譯或加速m RNA降解,參與基因轉錄后水平的調控。miRNA被證實在心臟發(fā)育以及疾病的病理進程中都發(fā)揮重要作用。例如,mi R-1促進胚胎干細胞向心肌細胞分化,而mi R-133抑制胚胎干細胞向心肌細胞分化。敲除mi R-21促進心肌細胞肥大,而過表達miR-21心肌肥厚反應減弱。過表達mi R-208a將導致心肌肥厚和心律失常。查閱法洛氏四聯癥mi R-array表達譜差異的文獻,我們發(fā)現miR-146b在法洛氏四聯癥高表達。以其他細胞缺氧模型為參考,mi R-146b在肺上皮細胞缺氧情況下高表達。北京安貞醫(yī)院一組研究人員研究發(fā)現,小型豬紫紺性心臟病模型中,mi R-146b在肺組織中高表達。這些結果都提示mi R-146b可能參與慢性缺氧心肌病理改變,其調控的方式還未見報道。核糖核酸酶L(ribonuclease L,RNase L)是2-5A系統(tǒng)成員,屬于MX家族。研究表明RNase L誘導依賴caspase級聯酶的細胞凋亡。此外,凋亡發(fā)生時,RNase L從胞漿移動到線粒體,改變ΔΨM(線粒體膜電位),產生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)。敲除RNase L后,相對于未敲除組細胞凋亡明顯減少,研究表明這部分是由JNK/c-Jun通路介導的。RNase L也可以通過間接影響IKK-κ和IKK-α影響NF-κB通路。tissue-specificgeneexpressionandregulation(tiger)數據庫顯示rnaselmrna在心臟組織中高表達,這表明它可能在心肌細胞病理生理進程中起到重要作用。研究目的本實驗擬在體內(臨床心肌標本)和體外(細胞)兩個水平檢測慢性缺氧條件下mir-146b的表達變化。在體外心肌細胞慢性缺氧模型中使用抑制劑改變mir-146b的表達,檢測改變mir-146b表達對缺氧h9c2心肌細胞的影響。同時通過生物信息學預測并由報告基因實驗確認mir-146b的靶基因。隨后檢測缺氧時下調mir-146b是否導致nf-κb和stat3的激活。最后我們下調靶基因rnasel,研究該基因在心肌細胞慢性缺氧中可能的作用。研究方法本研究分五部分:1.體內(臨床心肌標本)和體外(細胞)兩個水平檢測缺氧對mir-146b表達影響。1.1收集人心肌標本,紫紺組病人患有法洛四聯癥或肺動脈閉鎖合并室間隔缺損,非紫紺組病人患有右室流出道狹窄合并室間隔缺損),標本于手術中取自右室流出道。提取組織rna,采用rt-pcr檢測mir-146b在兩組病人標本中的表達情況。1.2將同一批次h9c2(大鼠心室肌細胞系)細胞置于低氧培養(yǎng)箱(1.0%o2、5.0%co2)中分別培養(yǎng)24h、48h及72h,對照組置于普通培養(yǎng)箱(21.0%o2)中培養(yǎng),利用rt-pcr技術檢測在心肌細胞系中隨著缺氧時間的延長mir-146b表達情況。2.探索mir-146b在h9c2細胞慢性缺氧中的作用及調控機制:2.1常氧時在h9c2細胞系中轉染帶綠色熒光的陰性對照,通過熒光顯微鏡觀測轉染效率。2.2向部分h9c2細胞中轉染化學合成的mir-146binhibitor(后簡稱146b-inh),建立常氧,慢性缺氧,慢性缺氧+轉染146b-inh,慢性缺氧+轉染146b-inhnc四個實驗組。通過ldh細胞毒性檢測,流式annexinv-fitc/pi檢測,hoechst染色,tunel染色,jc-1染色這幾種實驗方法測量各組細胞損傷或凋亡程度,探索下調mir-146b對缺氧心肌細胞損傷和凋亡的影響;利用western-blot方法檢測凋亡相關蛋白cleaved-caspse3,bcl-2和bax在各組中的表達情況;3.利用生物信息學數據庫targetscan預測mir-146b的靶基因。構建靶基因rnasel的野生型及突變型雙熒光素酶報告基因,將mir-146bmimic或其nc與野生型或突變型報告基因共轉染293t細胞,然后利用熒光照度計檢測報告基因相對熒光值,以此檢測mir-146b與rnaselmrna是否能物理結合;同時采用western-bolt技術,在h9c2細胞系中通過轉染146b-inh下調mir-146b后,檢測心肌細胞系中rnasel蛋白的表達變化。4.western-bolt檢測轉染mir-146binhibitor后缺氧情況下h9c2細胞中nf-κb信號通路關鍵蛋白p65及其磷酸化形式的表達變化,以及stat3蛋白及其磷酸化形式的表達變化。5.初步研究rnasel在心肌慢性缺氧中的表達及作用:5.1免疫組化檢測rnasel在人心肌組織中的表達情況。5.2在前述1.2構建的慢性缺氧心肌細胞模型中,利用rt-pcr及western-bolt技術檢測缺氧后rnaselmrna和蛋白的表達變化,以及rli蛋白表達變化。5.3設計并化學合成rnaselsirna,轉染h9c2細胞,利用rt-pcr方法檢測干擾效率,選取有效的sirna干擾序列。5.4利用流式annexinv-fitc/pi檢測缺氧情況下轉染rnaselsirna對凋亡的影響;實驗結果1.rt-pcr結果顯示mir-146b在紫紺型和非紫紺型先心病病人標本表達存在顯著差異,前者是后者的1.40倍(p0.05)。2.rt-pcr結果顯示在h9c2心肌細胞中mir-146b的表達量隨著缺氧時間的延長而逐漸增加,并在72h達到頂峰,達到常氧對照組的1.97倍(p0.05)。3.將inhibitor熒光陰性對照轉染h9c2細胞,熒光顯微鏡觀測結果顯示轉染效率達到75%以上。心肌細胞轉染mir-146b化學模擬物或抑制劑后缺氧72h,ldh細胞毒性實驗結果顯示,轉染mir-146bmimic可顯著減少細胞死亡(死亡率下降20.3%,p0.05),而轉染mir-146binhibitor則起到相反的結果(死亡率升高64%,p0.05)。我們接著利用流式annexinv-fitc/pi,tunel染色,hoechst染色及jc-1染色檢測缺氧心肌凋亡情況,結果顯示與nc組相比,轉染mir-146binhibitor均能顯著增加細胞凋亡(所有p0.05)。同時western-blot結果顯示轉染mir-146binhibitor后,cleaved-caspase3、bax的蛋白量顯著增加(分別升高73.0%和72.8%,p0.05),而bcl-2的表達下降37.2%(p0.05),bcl-2/bax也有明顯降低(下降64.0%,p0.05)。4.雙熒光素酶報告基因結果顯示共轉染mimic與野生型報告基因后可顯著降低熒光強度(下降30.9%,P0.05),而共轉染突變型報告基因與mimic則沒有這種差異(P0.05)。同時在H9c2細胞中轉染mi R-146b inhibitor后,RNase L蛋白表達增加6.61倍(P0.05)。5.H9c2心肌細胞轉染mi R-146b抑制劑后缺氧培養(yǎng)72h,Western-Blot結果顯示轉染miR-146b inhibitor并沒有改變p65和STAT3蛋白表達(P0.05),但這兩個蛋白的磷酸化水平顯著增加,分別為對照組的2.2倍和1.27倍(P0.05)。6.免疫組化結果顯示在人心肌組織標本中,RNase L高表達于心肌細胞及成纖維細胞,而較低表達于間質細胞(如血管內皮細胞)。7.利用RT-PCR和Western-Blot檢測發(fā)現心肌細胞缺氧后,RNase L m RNA和蛋白表達逐漸下調(RNase L m RNA缺氧72h與0h相比下降61.0%,P0.05),而它的抑制因子(RLI)蛋白表達增加。8.利用RT-PCR檢測沉默效率,發(fā)現設計的3對RNase L si RNA僅1對能有效沉默靶標基因,使RNase L m RNA水平下調52.3%(P0.05)。在H9c2細胞中干擾RNase L表達后置于缺氧孵箱中培養(yǎng)72h,流式Annexin V-FITC/PI檢測缺氧心肌的凋亡,結果顯示RNase L si RNA轉染組中凋亡細胞數量低于對照組(4.36%vs.NC 12.4%)。結論1.在病人心肌標本中,紫紺組mi R-146b表達高于非紫紺組,同時在體外慢性缺氧H9c2細胞模型中,隨著缺氧時間延長mi R-146b表達緩慢上升。2.在H9c2細胞系中,下調mi R-146b可顯著增加缺氧所致的心肌凋亡。3.生物信息學預測,同時雙熒光素酶報告基因和Western-Blot實驗證實RNase L為mi R-146b靶基因4.并且在心肌慢性缺氧模型中下調mi R-146b表達,NF-κB信號通路激活增加,STAT3磷酸化水平增加。5.RNase L蛋白在人心肌組織中表達,高表達于心肌細胞及成纖維細胞,而較低表達于間質細胞。H9c2細胞缺氧后RNase L在mRNA及蛋白水平都隨著缺氧時間延長逐漸降低,而RLI蛋白表達對應增加。下調RNase L表達,缺氧導致的心肌凋亡減少。其具體的作用機制有待進一步研究。
[Abstract]:In the 20th century , with the progress of screening and treatment technology , the cure rate of congenital heart disease is obviously improved , but the mortality of complex congenital heart disease is still high . The effect of mir - 146b on the expression of NF - 魏B and stat3 in cardiac muscle cells was studied . Conclusion : 1 . The expression of RNase L in human cardiac muscle tissue is higher than that of non - cyanosis group .

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.1

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本文編號：1685808