本文選題：雌二醇　切入點：表皮葡萄球菌　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：[背景和目的]假體植入乳房重建術(shù)是乳腺癌患者重要的整形手段,但術(shù)后包膜攣縮一直是難以解決的難題,其中假體植入過程中表皮葡萄球菌的污染成為術(shù)后包膜攣縮的主要因素,而細(xì)菌生物膜的形成是重要原因之一。表皮葡萄球菌生物膜的形成受眾多基因的調(diào)控,微環(huán)境的改變或調(diào)節(jié)因子的紊亂會使其表達發(fā)生變化,在乙醇存在的條件下可在體外誘導(dǎo)其表達,人體內(nèi)激素水平的改變也會導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)菌特性的改變。人體內(nèi)性激素水平的升高,會導(dǎo)致特定位置的細(xì)菌數(shù)量和毒力增加,從而使宿主出現(xiàn)相關(guān)感染。乳腺癌是一種激素依賴型腫瘤,大量流行病學(xué)調(diào)查已證實乳腺癌患者體內(nèi)雌激素水平較正常人群高,但對這類高雌激素水平的人群,其假體表面細(xì)菌生物膜形成能力的研究尚未見報道。雌激素與細(xì)菌生物膜形成、包膜攣縮之間相互作用的關(guān)系也尚不清楚。因此我們設(shè)想作為長期處于高雌激素水平的乳腺癌人群,是否她們的雌激素水平也會影響乳腺假體表面表皮葡萄球菌的生物學(xué)性狀,最終在假體包膜攣縮的發(fā)生過程中起不良作用。本研究的目的:通過體外實驗,觀察雌二醇對定植在乳腺假體表面表皮葡萄球菌生長和生物膜形成的影響。檢測雌二醇對表皮葡萄球菌aap、icaA、SarA、Lux、RNAⅢⅢ和icaR基因表達的影響。并建立乳腺硅膠材料表皮葡萄球菌感染動物模型,探討雌二醇水平在機體內(nèi)生物材料表面表皮葡萄球菌感染中的作用。第一部分:雌二醇對乳腺假體表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影響[目的]觀察不同雌二醇水平對假體表面表皮葡萄球菌生長、生物膜形成能力和生物膜結(jié)構(gòu)的影響。[方法]模擬乳腺癌患者體內(nèi)雌二醇水平,按照不同雌二醇濃度(0、50、125、250、500pmol/L)分為對照組和實驗組;以乳房硅膠為載體,選用表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC35984生物膜表型陽性、ATCC12228生物膜表型陰性)和臨床株(SE101生物膜表型陽性、SE40生物膜表型陰性)作為研究對象孵育4h、6h、12h、24h、48h和72h。根據(jù)OD值繪制出生長曲線;用結(jié)晶紫染色半定量檢測法評估生物膜初始黏附能力和形成能力。以前期實驗數(shù)據(jù)為依據(jù),選用表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC35984和ATCC12228)為研究對象,運用二甲氧唑黃(XTT)比色法檢測表皮葡萄球菌細(xì)菌生長動力,同時比較不同初始菌液濃度對生物膜形成過程的影響。在不同雌二醇濃度作用下,利用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)測量ATCC35984在硅膠材料表面孵育6h、12h和24h后形成的生物膜厚度,并觀察24h時生物膜的代謝狀態(tài)。掃描電子顯微鏡(SEM)觀察在不同雌二醇濃度下、不同時間點表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株細(xì)菌生物膜的超微結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]①細(xì)菌生長曲線:在無雌二醇作用的空白組中,ATCC35984、ATCC12228、SE101和SE40四株菌株都是在第4小時進入對數(shù)生長期。在125pmol/L雌二醇組中,四株表皮葡萄球菌都在第3小時就進入對數(shù)生長期,雌二醇組的表皮葡萄球菌菌株生長能力明顯優(yōu)于空白組。②表皮葡萄球菌初始粘附能力:ATCC35984和SE101在硅膠片上的初始黏附能力隨雌二醇濃度的增加而得到加強,且在125pmol/L時黏附能力是最強的(P0.05),之后隨雌二醇濃度的增加其黏附能力無明顯加強。而雌二醇對ATCC12228和SE40黏附在生物材料表面的能力無促進作用。③表皮葡萄球菌生物膜形成能力:在不同雌二醇濃度下,表皮葡萄球菌ATCC35984和SE101在硅膠材料表面形成的生物膜量隨著培養(yǎng)時間逐漸上升。在培養(yǎng)4h時已初步形成生物膜,6h生物膜就達到一定的厚度,24h時生物膜達到最厚,48h和72h形成的生物膜較24h有所下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。ATCC35984在生物膜形成早期(4～6h)時,細(xì)菌生物膜的形成能力隨雌二醇濃度增加出現(xiàn)抑制現(xiàn)象,其低雌二醇濃度組(≤50pmol/L)的生物膜較高雌二醇濃度組(≥125pmol/L)的厚,但從12h起形成的生物膜厚度就隨雌二醇濃度增加而顯著增加,并且在雌二醇濃度為125pmol/L作用下形成的生物膜最厚,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);SE101同樣在125pmol/L組中形成的生物膜最厚。當(dāng)雌二醇濃度≥250pmol/L時,生物膜厚度反之有所下降,但仍明顯大于低雌二醇濃度組(50pmol/L)。表皮葡萄球菌ATCC12228和SE40在不同濃度的雌二醇中均無明顯生物膜形成(OD0.12)。④細(xì)菌生長動力:ATCC12228和ATCC35984的OD值都隨培養(yǎng)時間的推移在不斷增加;同一時間點比較,OD值也都隨雌二醇濃度增加而增加(P0.05)。4～6h時兩株細(xì)菌的不同濃度雌二醇組生長都處于加速期,ATCC12228在12-48h時細(xì)菌生長速度較平緩,72h時又再次進入加速增長期;而ATCC35984在12-24時細(xì)菌生長速度較平緩,在48h時就進入加速增長期。當(dāng)雌二醇濃度≥125pmol/L時,兩株細(xì)菌在4h時的OD值明顯較0和50pmol/L雌二醇組的高(P0.05),隨時間的推移,雌二醇≥125pmol/L組的OD值一直都較≤50pmol/L組的高(P0.05)。⑤不同初始菌液濃度的ATCC35984細(xì)菌生長和生物膜形成:通過XTT法檢測細(xì)菌生長動力發(fā)現(xiàn)隨著培育時間的推移,1×l08CFU/mL菌液組的OD值始終高于l×l07CFU/mL菌液組。隨雌二醇濃度的增加,l×l07CFU/mL和l×l08CFU/mL菌液組生長速度都隨雌二醇濃度有增加;但不同于1×107CFU/mL菌液組的生長特征(④中已討論過),1×108CFU/mL菌液在4～6h時各個雌二醇濃度組之間的OD值差異無意義(P0.05),雌二醇≤50pmol/L組在12～24h時出現(xiàn)生長停滯情況,48h后又繼續(xù)加速生長;而雌二醇≥125pmol/L組的細(xì)菌生長速度一直都在不斷加速(P0.05)結(jié)晶紫染色法檢測到不同菌液濃度的表皮葡萄球菌ATCC35984形成生物膜的厚度隨時間推移不斷增加,4h和6h時,1×108CFU/mL菌液組的OD值明顯高于 1×107CFU/mL 組(P0.05);12h 時,1×108CFU/mL 菌液組的 OD 值與1×107CFU/mL組無明顯差異(P0.05);24～72h時,1×107CFU/mL菌液組的OD值明顯較1×108CFU/mL組大(P0.05)。1×107CFU/mL菌液組的OD值在24h是最大,而1×108CFU/mL菌液組的OD值在48h是最大,到72h時兩組菌液的OD值均低于48h。在相同時間點,1 ×107CFU/mL和1×108CFU/mL菌液在125pmol/L雌二醇組的OD值均大于其它雌二醇濃度組(P0.05)。⑥細(xì)菌生物膜厚度和代謝情況:CLSM測得6h時各雌二醇組生物膜厚度無明顯差異(P0.05);12～24h時雌二醇≥125pmol/L組的生物膜厚度均大于雌二醇≤50pmol/L組的,且雌二醇125pmol/L組的細(xì)菌生物膜厚度均明顯大于其他雌二醇濃度的菌組(P0.05);隨時間推移,各組細(xì)菌生物膜厚度不斷增加,24小時達到最大值(P0.05)。通過死/活菌染色觀察細(xì)菌生物膜的代謝情況,在細(xì)菌生物膜表層是以活菌為主,底層則以死菌為主。孵育12h時觀察到形成的生物膜以活菌為主,到24h時就出現(xiàn)大量的死菌。⑦細(xì)菌生物膜的超微結(jié)構(gòu):ATCC12228和SE40未見生物膜結(jié)構(gòu)。雌二醇濃度為125pmol/L時,ATCC35984和SE101在4h時可見初步形成的細(xì)菌團;6h時見大量細(xì)菌團覆蓋在硅膠片表面;12h時即見將細(xì)菌團相互連接的纖維組織形成;24h時就見蜂窩式成熟的細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu);48h和72h時見生物膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)分解。在雌二醇濃度為125pmol/L作用下形成的細(xì)菌生物膜范圍最廣、結(jié)構(gòu)最致密、最豐富、層次最多。[結(jié)論]1.雌二醇能促進表皮葡萄球菌生長,且細(xì)菌生長動力有雌二醇濃度依賴性,提示雌二醇可能在維持細(xì)菌生存方面起一定作用。2.在表皮葡萄球菌生物膜形成過程中,高濃度雌二醇能顯著增強細(xì)菌初始黏附能力,促進生物膜后期的大量形成,這可能是高雌二醇水平患者容易形成細(xì)菌生物膜的重要因素之一。3.生物膜形成陽性株在合適的高濃度雌二醇下,形成的生物膜更致密、多細(xì)胞群體組成的結(jié)構(gòu)更加高度組織化,這可能是乳腺癌患者假體術(shù)后感染難治的原因之一。第二部分:雌二醇對表皮葡萄球菌生物膜相關(guān)基因的影響[目的]探討雌二醇影響表皮葡萄球菌生物膜的可能分子機制。[方法]利用Real-time PCR法檢測表皮葡萄球菌在雌二醇濃度分別為0、50、125、250、500pmol/L(模擬乳腺癌患者體內(nèi)雌二醇水平)的條件下培養(yǎng)12h、24h、48h和72h后,正調(diào)控基因(aap、icaA、SarA)和負(fù)調(diào)控基因(Lux、RNAⅢ、icaR)mRNA表達的變化,了解相關(guān)基因在不同雌二醇濃度、不同時間下的表達情況。[結(jié)果]①aap基因在生物膜的形成期(12h)和成熟階段(24h)時都出現(xiàn)表達增強,且在E2濃度為125pmol/L作用下表達最顯著;②在生物膜形成的12h時,icaA的表達并未出現(xiàn)表達增強,但在24h時觀察到在125pmol/L雌二醇作用下icaA基因mRNA開始出現(xiàn)輕度上調(diào),到48h時250pmol/L雌二醇作用下icaA基因的mRNA出現(xiàn)顯著上調(diào);③在12h時,sarA的mRNA在所有雌二醇濃度中都是下調(diào),但有隨雌二醇濃度增加而上調(diào)的趨勢,24h時在125pmol/L組出現(xiàn)明顯上調(diào),48h時在250pmol/L組出現(xiàn)顯著上調(diào)。④在表皮葡萄球菌生物膜形成期(12h)和新生物膜建立期(72h),LuxS都是被抑制的,且隨著雌二醇濃度的增加LuxS的抑制更顯著;⑤RNAⅢ基因在生物膜形成的48h時,在125pmol/L組表達增強;在72h時,隨雌二醇濃度增加RNAⅢ基因被抑制;⑥在生物膜形成的12h時,icaR基因mRNA隨雌二醇濃度增加是下調(diào)的,24h和48h時出現(xiàn)表達增強,并且24h時在E2濃度為125pmol/L作用下表達增強最顯著;[結(jié)論]1.在生物膜形成初期,正調(diào)控基因占主導(dǎo)地位;在生物膜成熟后期,正調(diào)控基因作用較前減弱,同時負(fù)調(diào)控基因開始發(fā)揮作用;在生物開始膜崩解時,負(fù)調(diào)控基因占主導(dǎo)地位。2.高濃度雌二醇作用下,正調(diào)控基因和負(fù)調(diào)控基因作用都得到加強,提示雌二醇可能通過同時影響正、負(fù)調(diào)控基因達到促進生物膜形成的作用。第三部分:雌二醇對卵巢去勢大鼠體內(nèi)假體細(xì)菌生物膜的影響以及與包膜攣縮的關(guān)系[目的]建立不同雌二醇血清水平的大鼠模型,探討雌二醇對動物體內(nèi)假體細(xì)菌生物膜形成和包膜攣縮的作用,評價雌二醇對動物清除感染能力的影響。[方法]利用雙側(cè)卵巢去勢手術(shù)和雌二醇注射,模擬建立具有不同雌二醇血清水平的動物模型;植入硅膠片、注入表皮葡萄球菌(ATCC12228或ATCC35984)感染實驗動物,感染60天后處死大鼠,計算主要臟器的感染率和感染細(xì)菌的菌落計數(shù),同時利用顯微鏡觀察感染臟器炎性細(xì)胞的浸潤情況;掃描電鏡觀察硅膠片表面生物膜的形成情況;病理方法觀察攣縮包膜的結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]①去勢組大鼠雌二醇濃度為46.886(±3.965)pmoL/L,高E2組大鼠的雌二醇濃度為 152.381(±10.455)pmoL/L,低 E2 組大鼠的雌二醇濃度84.962(±24.735)pmoL/L(P0.05);②在高E2組中,感染ATCC35984的實驗老鼠臟器感染率增高,菌落數(shù)也顯著高于正常組和低E2組(P0.05);③高E2組中發(fā)生高達80%的包膜攣縮率(GradeⅢ/Ⅳ),顯微鏡下可見大量致密的纖維組織結(jié)構(gòu);掃描電鏡下觀察到ATCC35984感染下,高E2組中見明顯成熟的細(xì)菌生物膜形成;④動物在感染ATCC35984的第1、3、7天時,低E2組的血清IFN-γ、TNF-α水平均顯著高于高E2組,高E2組的IL-6、Ig-G顯著高于低E2組(P0.05);⑤ATCC35984感染后,高E2組中CD3、CD4、CD4/CD8水平均從感染第1天就出現(xiàn)下降,至感染第3天達到最低水平,隨后逐漸上升;CD8水平從感染第1天開始出現(xiàn)上升,至感染第3天達到最高水平,隨后逐漸下降(P0.05)。[結(jié)論]1.利用去勢手術(shù)可成功構(gòu)建不同雌二醇血清水平的大鼠模型;2.高濃度的雌二醇能提高假體包膜攣縮發(fā)生率,促進膠原纖維的增生,形成厚而致密的包膜,這可能是誘發(fā)假體包膜攣縮的重要因素之一;3.高濃度的雌二醇能誘導(dǎo)大量炎性細(xì)胞的浸潤,使周圍組織發(fā)生嚴(yán)重的炎性反應(yīng);進一步加重感染宿主的免疫失衡狀態(tài),增加感染播散的風(fēng)險,這可能是造成宿主免疫系統(tǒng)紊亂的原因之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R655.8

【參考文獻】

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