本文選題：牙周炎　切入點：凝血酶敏感蛋白-1　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:慢性牙周炎是常見的慢性非特異性細菌感染性疾病,是成人牙齒缺失的重要原因。以牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)等口腔微生物感染為始動因素,細菌—宿主之間的相互作用促進了牙周組織的炎癥性變化。P.gingivalis細胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是強烈的免疫激動劑,可以激活宿主的免疫反應(yīng),激活相關(guān)信號通路。單核巨噬細胞在吞噬病原體起到防御作用的同時,釋放大量炎癥介質(zhì)、細胞因子,如白細胞介素(Interleukins,ILs)和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-ɑ,可以直接引起持續(xù)的免疫反應(yīng),造成組織繼發(fā)性的損傷;還可以作為信使因子,將信息傳遞給其他細胞,調(diào)節(jié)細胞生長、分化與炎性介質(zhì)的分泌等。牙周膜成纖維細胞(Human periodontal ligament fibroblasts,h PDLFs)是牙周膜中數(shù)目最多,功能最重要的細胞。h PDLFs不僅是一種機械屏障,同時也具有免疫調(diào)節(jié)作用,可以合成細胞外基質(zhì)中各型膠原纖維和蛋白多糖,在不同的微環(huán)境誘導(dǎo)下,也能表達多種蛋白酶、溶解素,導(dǎo)致牙周組織中基質(zhì)成分分解和膠原纖維降解。作為具有成骨能力的細胞群體,h PDLFs還可調(diào)控核因子-κB受體活化因子配體(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)及其餌受體骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)的表達,是牙周組織改建、再生和修復(fù)的基礎(chǔ)。凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)來自于血小板反應(yīng)蛋白家族,由Baenziger等1971年從凝血酶激活的血小板ɑ顆粒中分離。繼而發(fā)現(xiàn)在多組織器官和多類別的細胞中都有表達。TSP-1是最早發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制劑之一,也是TGF-β的經(jīng)典活化劑。近年來的研究發(fā)現(xiàn),TSP-1在感染和炎癥免疫性疾病中也發(fā)揮重要的作用。TSP-1可以通過直接結(jié)合革蘭陽性菌或者介導(dǎo)細菌與血小板的結(jié)合提高致病性,通過激活宿主免疫反應(yīng)提升致炎因子的釋放,同時降低對病菌的吞噬來造成致病菌長期定植,造成遷延不愈的炎癥性損傷。2014年,Gokyu首次在牙周炎局部牙齦組織中檢測到TSP-1的高表達,但是其具體的致病機制尚不明確。目的:鑒于TSP-1在其他炎癥疾病中的功能,本研究旨在探討TSP-1在促進慢性牙周炎發(fā)病進程中作用,特別是對于巨噬細胞和h PDLFs生長和炎癥相關(guān)細胞因子的調(diào)節(jié)作用,以闡明慢性牙周炎的分子機制,為臨床防治提供新思路和新策略。方法:收集慢性牙周炎和正常牙周的牙齦組織,采用HE染色、免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色的方法,檢測TSP-1的表達以及主要的細胞來源。以人單核細胞系THP-1來源的巨噬細胞和原代培養(yǎng)的h PDLFs為對象——開展體外研究。采用P.gingivalis LPS作為刺激細胞的活化劑,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染TSP-1 si RNA和p TT3-TSP-1過表達質(zhì)粒,檢測THP-1巨噬細胞TSP-1,IL-6,IL-1β和TNF-ɑ的表達,細胞凋亡和周期的改變,以及NF-кB信號通路中p65和IκBα蛋白的改變;并在此基礎(chǔ)上,利用巨噬細胞與h PDLFs共培養(yǎng)的模型,觀察P.gingivalis LPS活化并過表達TSP-1的THP-1巨噬細胞對正常的h PDLFs的影響,檢測h PDLFs細胞凋亡和周期的改變,以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2,MMP-9)的表達。此外,瞬時轉(zhuǎn)染TSP-1si RNA和p TT3-TSP-1過表達質(zhì)粒至h PDLFs,探討TSP-1對h PDLFs的直接作用。檢測h PDLFs細胞活力、凋亡、周期及相關(guān)蛋白PCNA和caspase-1的表達;膠原破壞相關(guān)蛋白(MMP-2,MMP-9,TIMP-1)的表達;破骨相關(guān)因子(RANKL、OPG)的表達;和MAPK信號通路中p38MAPK,ERK1/2,JNK蛋白的改變。結(jié)果:(1)慢性牙周炎的牙齦組織中TSP-1的表達高于正常對照組,且可與CD68和vimentin共定位,表明CD68+巨噬細胞和vimentin+牙周膜成纖維細胞是TSP-1的重要來源。(2)組織塊法可以分離培養(yǎng)波蛋白陽性、角蛋白陰性的人原代牙周膜成纖維細胞。(3)P.gingivalis LPS能夠活化THP-1細胞,在一定范圍內(nèi)隨著P.gingivalis LPS的濃度和作用時間的增加,TSP-1,IL-6,IL-1β和TNF-ɑ的表達均有所增加。TSP-1可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的生長和炎性介質(zhì)的分泌:瞬時轉(zhuǎn)染TSP-1 si RNA,在抑制TSP-1表達的同時,能夠抑制IL-6,IL-1β和TNF-ɑ的m RNA和蛋白表達,促進P.gingivalis LPS引起的THP-1細胞的凋亡;抑制了P.gingivalis LPS引起的NF-κB信號通路中p65和IκBα蛋白磷酸化水平。THP-1細胞轉(zhuǎn)染p TT3-TSP-1之后,取得了相反的效果:IL-6,IL-1β和TNF-ɑ表達上調(diào),P.gingivalis LPS引起的細胞凋亡受到抑制,進一步活化NF-κB通路,促進了p65和IκBα磷酸化蛋白的表達。NF-κB通路特異性阻滯劑PDTC可以阻斷TSP-1對NF-κB的活化作用,繼而拮抗TSP-1對P.gingivalis LPS活化的THP-1細胞分泌炎性因子的促進作用。(4)P.gingivalis LPS活化的THP-1細胞能對正常h PDLFs產(chǎn)生一定的損傷,轉(zhuǎn)染p TT3-TSP-1,進一步促進h PDLFs細胞的凋亡,改變細胞周期的(S+G2)/M相,增加MMP-2,MMP-9的表達。(5)P.gingivalis LPS能夠活化h PDLFs,P.gingivalis LPS在一定程度上,呈時間和劑量依賴性促進TSP-1,MMP-2,MMP-9的表達。TSP-1能夠直接調(diào)節(jié)h PDLFs的生長和細胞因子的分泌。轉(zhuǎn)染TSP-1 si RNA后,MMP-2和MMP-9的表達下降,TIMP-1的表達升高,破骨相關(guān)因子RANKL/OPG的比值下降,細胞活力增加,凋亡減少,以及相關(guān)蛋白PCNA增加,Caspase-1(p20)減少;MAPK信號通路中p38,ERK1/2和JNK磷酸化蛋白減少。轉(zhuǎn)染過表達TSP-1質(zhì)粒之后,結(jié)果相反:促進MMP-2,MMP-9的表達,TIMP-1的表達下降;RANKL/OPG的比值升高;細胞活力降低,凋亡增加;PCNA的下調(diào),Caspase-1(p20)增加;p38,ERK1/2和JNK蛋白磷酸化水平升高。結(jié)論:本研究結(jié)果顯示,慢性牙周炎炎癥組織中高表達的TSP-1,可以作為重要的炎癥介質(zhì),調(diào)節(jié)炎癥局部巨噬細胞與牙周膜成纖維細胞的生長和炎性因子的分泌,從而參與慢性牙周炎的發(fā)病進程,此研究發(fā)現(xiàn)可以更好的深入理解慢性牙周炎的發(fā)病機制,從而為牙周炎防治策略以及臨床靶向治療提供線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R781.4

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本文編號：1665989