本文選題：SIRT6　切入點(diǎn)：沃伯格效應(yīng)　出處：《西南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：近年來,代謝異常在腫瘤中的影響被廣泛關(guān)注,且被認(rèn)為是腫瘤最重要的標(biāo)識之一。正常細(xì)胞依賴三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量,而腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的情況下也主要依賴糖酵解產(chǎn)生能量,以維持其快速增殖,這就是所謂的沃伯格效應(yīng),也稱有氧糖酵解。腫瘤細(xì)胞吸收的葡萄糖大多數(shù)經(jīng)過糖酵解生成乳酸,而且生成大量的中間產(chǎn)物,為合成腫瘤細(xì)胞異常增殖所需的核苷酸、磷脂和蛋白質(zhì)等提供物質(zhì)基礎(chǔ)�？梢娢植裥�(yīng)在細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的作用,可以為腫瘤治療提供潛在的靶標(biāo),然而其中具體的分子機(jī)制尚未明晰。SIRT6作為第三類去乙酰化轉(zhuǎn)移酶家族重要的一員,具有去乙�；富钚院蛦蜛DP轉(zhuǎn)移酶活性等。SIRT6的缺失的小鼠在生命的早期表現(xiàn)出致命的低血糖癥,伴隨著循環(huán)血中的IGF-1的水平的急劇下降。隨后,在小鼠的心臟組織中,SIRT6被證明能夠與c-Jun結(jié)合并抑制IGF-Akt信號通路。并且在肌肉和肝臟組織中,SIRT6過表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞對胰島素的敏感性。以上顯示SIRT6與糖代謝有著密不可分的聯(lián)系。本研究利用SIRT6乙�；蛔凅wSIRT6Y257F,在腫瘤細(xì)胞中探討SIRT6的去乙�；D(zhuǎn)移酶活性對腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及沃伯格效應(yīng)的影響,并進(jìn)一步探討了SIRT6與CDK4-CCND1信號通路的調(diào)控關(guān)系,以及SIRT6去乙酰化酶活性對CDK4蛋白活性的影響。為SIRT6調(diào)控沃伯格效應(yīng)提供新的分子機(jī)制,為SIRT6作為癌癥治療的潛在靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:1.SIRT6抑制腫瘤增殖依賴其去乙�；钚詾榱舜_認(rèn)SIRT6與腫瘤惡性增殖的關(guān)系,我們首先在多個腫瘤中敲低了SIRT6的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SIRT6表達(dá)下調(diào)引起腫瘤細(xì)胞異常增殖;Brdu實(shí)驗(yàn)也顯示SIRT6表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞表現(xiàn)出更多的陽性率。軟瓊脂實(shí)驗(yàn)顯示SIRT6表達(dá)下調(diào)細(xì)胞具有更高的克隆形成能力。除此之外,動物實(shí)驗(yàn)也顯示SIRT6表達(dá)下調(diào)細(xì)胞在體內(nèi)形成的腫瘤體積顯著增大,腫瘤重量明顯增重。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT6去乙酰化酶活性對異常增殖的影響,我們構(gòu)建了一個SIRT6去乙酰化突變失活體SIRT6Y257F,即將SIRT6第257位親水的酪氨酸突變?yōu)槭杷谋奖彼�。通過在SIRT6表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞中恢復(fù)SIRT6及SIRT6Y257F的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)SIRT6的表達(dá)恢復(fù)挽救了SIRT6表達(dá)下調(diào)引起的細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力。然而,在SIRT6表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞中恢復(fù)SIRT6去乙酰化酶失活體SIRT6Y257F,卻不能挽救SIRT6表達(dá)下調(diào)引起的細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力。這些結(jié)果表明,SIRT6抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力依賴其去乙酰化酶活性。2.SIRT6抑制腫瘤遷移和侵襲依賴其去乙酰化活性除了對增殖的影響,我們也對SIRT6表達(dá)下調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系進(jìn)行了探討。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示SIRT6表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞相對于對照組具有更強(qiáng)的遷移能力;進(jìn)一步利用Tranwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測,結(jié)果顯示SIRT6表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。因?yàn)榧?xì)胞黏附常和遷移侵襲相關(guān),我們進(jìn)行了細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示SIRT6沉默后細(xì)胞的粘附能力顯著增強(qiáng)。為了驗(yàn)證SIRT6去乙�；富钚耘c腫瘤遷移和侵襲之間的聯(lián)系。同樣地,我們進(jìn)行Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示SIRT6的表達(dá)恢復(fù)挽救了SIRT6表達(dá)下調(diào)引起的細(xì)胞遷移及侵襲能力的增強(qiáng),而SIRT6Y257F的表達(dá)恢復(fù)卻不能挽救SIRT6表達(dá)下調(diào)引起的細(xì)胞遷移及侵襲能力的增強(qiáng)。這些結(jié)果表明,SIRT6抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力依賴其去乙�；富钚浴�3.SIRT6抑制沃伯格效應(yīng)依賴其去乙�；钚砸�?yàn)槟[瘤的增殖和轉(zhuǎn)移往往與其細(xì)胞代謝的紊亂密切相關(guān)。我們首先利用一種葡萄糖的熒光替代物2-NBDG在SIRT6表達(dá)敲低的細(xì)胞中進(jìn)行葡萄糖攝取能力的檢測,免疫熒光實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SIRT6表達(dá)敲低后腫瘤細(xì)胞對葡萄糖攝取能力顯著增強(qiáng);除此之外,我們利用化學(xué)檢測方法分別檢測了葡萄糖消耗量、乳酸產(chǎn)生量及乳酸脫氫酶LDH的活性,結(jié)果也顯示在SIRT6表達(dá)降低的細(xì)胞中葡萄糖消耗量和乳酸產(chǎn)生量明顯增多,且LDH活性也明顯增強(qiáng);利用RT-PCR檢測糖酵解中關(guān)鍵基因的表達(dá)量,結(jié)果顯示糖酵解關(guān)鍵基因如glut1、glut4、hk1、hk2、hk3、gapdh、pfk1、pkm2、ldh-a1和ldh-a2的表達(dá)量明顯升高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT6去乙�；富钚耘c沃伯格效應(yīng)的關(guān)系,我們在SIRT6表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞中恢復(fù)SIRT6及SIRT6Y257F的表達(dá)。結(jié)果顯示,SIRT6表達(dá)的恢復(fù)挽救了SIRT6表達(dá)下調(diào)引起的腫瘤細(xì)胞葡萄糖攝取能力的增強(qiáng),同時挽救了葡萄糖消耗量和乳酸產(chǎn)生量的增多以及LDH活性的增強(qiáng)。除此之外,SIRT6表達(dá)恢復(fù)后糖酵解關(guān)鍵基因的表達(dá)量也明顯增高。然而,SIRT6去乙酰化失活體SIRT6Y257F的恢復(fù)卻不能挽救SIRT6下調(diào)引起的葡萄糖攝取能力的增強(qiáng)、葡萄糖消耗量的增多、乳酸產(chǎn)生量的增多、LDH活性的增強(qiáng),以及糖酵解關(guān)鍵基因表達(dá)量的增高。這些結(jié)果顯示,SIRT6抑制沃伯格效應(yīng)依賴其去乙�；钚浴�4.SIRT6轉(zhuǎn)錄調(diào)控CDK4和CCND1的表達(dá)因?yàn)榻陙硌芯堪l(fā)現(xiàn)CDK4-CCND1蛋白復(fù)合體在糖代謝的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用。為了驗(yàn)證SIRT6是否與CDK4-CCND1有關(guān),我們利用Western Blot檢測了CDK4及CCND1的表達(dá),結(jié)果顯示SIRT6敲低后,CDK4及CCND1的表達(dá)顯著下調(diào);除此之外,糖酵解相關(guān)蛋白GLUT1、PKM2及GAPDH的表達(dá)卻顯著上升。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CDK4-CCND1是否為SIRT6的下游,我們在SIRT6過表達(dá)的細(xì)胞中敲低CDK4及CCND1,結(jié)果顯示,CDK4及CCND1的敲低能夠上調(diào)GLUT1、PKM2及GAPDH的表達(dá),而對SIRT6的表達(dá)沒有影響。進(jìn)一步地,我們利用在SIRT6過表達(dá)的細(xì)胞中下調(diào)CDK4及CCND1的表達(dá),結(jié)果顯示CDK4及CCND1的敲低能夠逆轉(zhuǎn)SIRT6引起的糖酵解的降低。利用CDK4的抑制劑PD0332991處理SIRT6過表達(dá)的細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PD0332991消除了SIRT6引起的葡萄糖吸收的降低、葡萄糖消耗量的減少、乳酸產(chǎn)生量的減少、LDH活性的降低以及糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的降低。這些結(jié)果表明CDK4及CCND1是SIRT6的下游。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT6是如何調(diào)控CDK4及CCND1的表達(dá)的。我們首先在CDK4和CCND1的E-box區(qū)域和外顯子區(qū)域設(shè)計引物,利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測SIRT6是否結(jié)合到CDK4和CCND1啟動子區(qū)域。結(jié)果顯示,SIRT6能夠富集到CDK4和CCND1的E-box區(qū)域。進(jìn)一步地,我們利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT6對CDK4和CCND1啟動子E-box的調(diào)節(jié),結(jié)果顯示,SIRT6下調(diào)引起CDK4和CCND1啟動子E-box區(qū)域活性降低,而對E-box區(qū)域外的啟動子序列的活性沒有調(diào)節(jié)能力。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SIRT6能夠結(jié)合到CDK4及CCND1啟動子E-box序列,從而轉(zhuǎn)錄調(diào)控其表達(dá)。5.SIRT6直接結(jié)合CDK4-CCND1復(fù)合體并將CDK4去乙酰化文獻(xiàn)報道SIRT6可能與CCNDBP1直接結(jié)合,然而并沒有進(jìn)一步驗(yàn)證。因?yàn)镃CND1與CCNDBP1是直接結(jié)合的,因此我們猜想SIRT6可能與CDK4-CCND1有直接的相互作用。為了驗(yàn)證我們的猜想,我們進(jìn)行了免疫共沉淀的研究。首先用SIRT6的抗體沉淀后,WB結(jié)果顯示CDK4和CCND1都被共沉淀下來;反之,分別利用CDK4和CCND1的抗體反向沉淀后,WB結(jié)果顯示SIRT6都被沉淀下來。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT6去乙�；δ苋绾瓮ㄟ^直接結(jié)合來調(diào)控CDK4-CCND1的活性,我們首先查閱了CDK4和CCND1蛋白質(zhì)序列上可能的乙酰化位點(diǎn),結(jié)果顯示在小鼠中只有CDK4第35位賴氨酸被乙�；�,而且該乙酰化位點(diǎn)被預(yù)測能夠影響CDK4與ATP結(jié)合的效率。接下來,我們首先利用CDK4的抗體將CDK4沉淀下來,WB檢測發(fā)現(xiàn)SIRT6敲低后CDK4乙酰化程度增高,而且恢復(fù)SIRT6表達(dá)后CDK4乙�；档拖聛�,但是恢復(fù)SIRT6乙酰化活性突變體卻不能降低CDK4乙�；潭�。進(jìn)一步地將CDK4第35位賴氨酸突變?yōu)樘K氨酸,構(gòu)建出CDK4K35T突變體。在SIRT6敲低的細(xì)胞中過表達(dá)CDK4及CDK4K35T,結(jié)果顯示CDK4過表達(dá)能夠引起糖酵解關(guān)鍵蛋白GLUT1、PKM2、GAPDH等表達(dá)降低、葡萄糖吸收能力的減弱、葡萄糖消耗量的減少、乳酸生成量的減少、LDH活性的減弱、以及糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的降低。而過表達(dá)CDK4K35T卻進(jìn)一步引起腫瘤細(xì)胞中沃伯格效應(yīng)的減弱。以上結(jié)果表明,SIRT6能夠?qū)DK4第35位賴氨酸去乙�；�,從而抑制了沃伯格效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5

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