本文選題：腹主動(dòng)脈瘤　切入點(diǎn)：血管平滑肌細(xì)胞　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:SM22α是成熟血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表達(dá)的一種細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白,在多種情況下作為銜接蛋白聚合信號(hào)復(fù)合物并調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。SM22α缺失可誘發(fā)血管炎癥,促進(jìn)NF-κB活化。腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一種危害生命的慢性炎癥性血管疾病,其形成與多種因素有關(guān)。研究顯示,在動(dòng)脈夾層組織和人AAA組織中SM22α豐度明顯減少。然而,SM22α與動(dòng)脈瘤發(fā)生之間的因果關(guān)系缺乏明確證據(jù)。本研究探討缺失SM22α對(duì)腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生的影響及病理機(jī)制。方法:利用SM22α基因敲除和同窩野生型小鼠經(jīng)背部皮下植入AngⅡI微滲透泵復(fù)制AAA模型,在整體水平評(píng)價(jià)SM22α與Ang Ⅱ誘導(dǎo)的AAA關(guān)系;用定量RT-PCR、Western blot技術(shù)和免疫熒光染色檢測蛋白mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá);用免疫熒光染色確定炎癥部位促炎因子表達(dá)和炎性細(xì)胞的浸潤;用間接共培養(yǎng)體系,確定VSMCs缺失SM22α活化巨噬細(xì)胞;用跨膜遷移分析和粘附分析確定VSMCs缺失SM22α對(duì)巨噬細(xì)胞遷移和粘附的影響;用細(xì)胞外分泌組學(xué)分析進(jìn)一步闡明SM22α缺失在巨噬細(xì)胞與VSMCs粘附中的作用機(jī)制;利用抗體阻斷實(shí)驗(yàn),確定SM22α缺失增加巨噬細(xì)胞活化、遷移和粘附是通過上調(diào)VCAM-1實(shí)現(xiàn)的;用免疫共沉淀分析和免疫雙熒光染色,確定F-actin和VCAM-1具有相互作用,并明確其相互作用發(fā)生在皮層區(qū)。結(jié)果:1 SM22α缺陷促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤形成1.1SM22α缺失有助于Ang Ⅱ誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈瘤形成對(duì)腹部主動(dòng)脈瘤模型分析結(jié)果顯示,輸注Ang Ⅱ的Sm22α-/-小鼠和Sm22α+/+小鼠在腹主動(dòng)脈部位均有動(dòng)脈瘤形成,發(fā)病率分別為66.7%(10/15)和26.7%(4/15),Sm22α-/-小鼠AAA發(fā)病率明顯高于Sm22α+/+小鼠(P0.05)。小動(dòng)物超聲活體測量腹主動(dòng)脈直徑顯示,Sm22α-/-小鼠的腹主動(dòng)脈最大直徑顯著高于Sm22α+/+小鼠(P0.01)。結(jié)果表明,SM22α缺失促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)AAA形成。1.2SM22α缺失促進(jìn)MMP-2、MMP-9釋放,彈力纖維和膠原蛋白降解植泵28天剝?nèi)「怪鲃?dòng)脈進(jìn)行組織包埋,取Sm22α-/-小鼠腹部動(dòng)脈瘤部位和Sm22α+/+小鼠相等部位切片,對(duì)組織切片進(jìn)行HE、EVG和免疫熒光染色,結(jié)果顯示,Sm22α-/-小鼠腹主動(dòng)脈瘤部位管腔膨脹,管壁增厚,彈力纖維斷裂和膠原蛋白降解,病變程度比Sm22α+/+小鼠更為明顯。定量RT-PCR、Western blot和組織免疫熒光染色檢測MMP-2和MMP-9表達(dá),結(jié)果顯示,與生理鹽水對(duì)照組相比,Ang Ⅱ促進(jìn)小鼠腹主動(dòng)脈組織MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá);而Sm22α-/-小鼠腹主動(dòng)脈MMP-2和MMP-9表達(dá)明顯高于Sm22α+/+小鼠。結(jié)果表明,SM22α缺失促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的MMP-2和MMP-9表達(dá),導(dǎo)致血管細(xì)胞外基質(zhì)降解,管壁結(jié)構(gòu)重塑。1.3SM22α缺失導(dǎo)致的腹主動(dòng)脈瘤是血壓非依賴的為了驗(yàn)證Sm22α-/-小鼠AAA的形成是否與高血壓有關(guān),通過智能無創(chuàng)血壓計(jì)監(jiān)測小鼠血壓變化,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,兩種基因型小鼠注入Ang Ⅱ第1周血升壓開始明顯升高,直至第4周血壓持續(xù)升高,但第3周和第4周Sm22α-/-小鼠的血壓升高明顯低于Sm22α+/+小鼠(P0.001),表明Sm22α-/小鼠增加的AAA發(fā)生率不依賴于AngⅡ誘發(fā)的高血壓。2敲除SM22α促進(jìn)血管中膜巨噬細(xì)胞浸潤和活化2.1SM22α缺失增加血管炎癥對(duì)組織切片進(jìn)行免疫熒光染色,結(jié)果顯示,在Ang Ⅱ作用下,大量巨噬細(xì)胞聚集在Sm22α-/-小鼠中膜。主動(dòng)脈組織定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示,在Ang Ⅱ作用下,兩種基因型小鼠腹主動(dòng)脈組織中促炎因子IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 表達(dá)上調(diào),而Sm22α-/-小鼠促炎因子的表達(dá)明顯高于Sm22α+/+小鼠(P0.001)。以上結(jié)果表明,SM22α缺失是通過增加巨噬細(xì)胞浸潤和促炎因子釋放增強(qiáng)炎癥反應(yīng)促進(jìn)AAA發(fā)生。2.2SM22α缺失促進(jìn)巨噬細(xì)胞募集為了進(jìn)一步探討SM22α缺失是否直接影響巨噬細(xì)胞的聚集,通過VSMCs-RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng),檢測敲除SM22α對(duì)巨噬細(xì)胞跨膜遷移和粘附的影響。跨膜遷移和粘附分析結(jié)果顯示,在Ang Ⅱ作用下,RAW264.7細(xì)胞的跨膜遷移增強(qiáng),同時(shí)與VSMCs粘附的數(shù)量增多,而與野生型VSMCs相比,SM22α缺失明顯增加RAW264.7細(xì)胞的跨膜遷移和(P0.001)與VSMCs粘附能力(P0.01);然而,當(dāng)Sm22α-/-小鼠VSMCs恢復(fù)SM22α表達(dá)后明顯降低對(duì)RAW264.7細(xì)胞跨膜遷移(P0.001)和與VSMCs粘附的促進(jìn)作用(P0.01)。以上結(jié)果表明,SM22α缺失通過直接影響巨噬細(xì)胞的遷移和粘附,促使巨噬細(xì)胞募集。2.3SM22α缺失促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化用AngⅡ刺激Sm22α-/-和Sm22α+/+小鼠VSMCs后,收集細(xì)胞培養(yǎng)基。定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示,與野生型相比,Sm22α-/-小鼠VSMCs條件培養(yǎng)基明顯促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1(P0.001),誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化。然而,當(dāng)Sm22α-/-小鼠VSMCs恢復(fù)SM22α表達(dá)后,則對(duì)巨噬細(xì)胞的活化能力降低。結(jié)果表明,缺失SM22α的VSMCs可激活巨噬細(xì)胞表達(dá)促炎因子。3 SM22α缺失促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞VCAM-1表達(dá)3.1血管平滑肌細(xì)胞外分泌組學(xué)分析對(duì)VSMCs培養(yǎng)基進(jìn)行外分泌蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果顯示,在外分泌差異蛋白中,Sm22α-/-來源的可溶性VCAM-1(sVCAM-1)的表達(dá)是野生型的25.6倍,是差異最顯著的一種粘附分子。3.2敲除SM22α促進(jìn)VCAM-1表達(dá)VCAM-1在單核細(xì)胞浸潤過程中發(fā)揮重要作用。對(duì)兩種基因型小鼠的主動(dòng)脈組織分別進(jìn)行Western blot和免疫熒光染色,結(jié)果顯示,在Ang Ⅱ植泵的Sm22α-/-小鼠主動(dòng)脈中VCAM-1表達(dá)明顯高于野生型小鼠。對(duì)體外培養(yǎng)的VSMCs培養(yǎng)基和膜蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,與野生型VSMCs相比,缺失SM22α促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá),細(xì)胞膜表面VCAM-1和sVCAM-1表達(dá)同時(shí)升高(P0.001)。然而,補(bǔ)救表達(dá)SM22α的細(xì)胞其VCAM-1表達(dá)明顯受到抑制,細(xì)胞膜表面VCAM-1和sVCAM-1明顯減少(P0.05)。結(jié)果表明,SM22α對(duì)VCAM-1表達(dá)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。3.3SM22α缺失通過上調(diào)VCAM-1介導(dǎo)巨噬細(xì)胞募集為了進(jìn)一步明確VCAM-1在巨噬細(xì)胞浸潤中的功能,收集Ang Ⅱ刺激的Sm22α-/-小鼠細(xì)胞培養(yǎng)基,用抗VCAM-1抗體中和培養(yǎng)基中的sVCAM-1,觀察其對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示,中和培養(yǎng)基sVCAM-1后,其誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞跨膜遷移明顯減少(P0.001),RAW264.7 細(xì)胞中 TNF-α、MCP-1、IL-1β 和 IL-6 mRNA 表達(dá)明顯下降。為了驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn),用重組VCAM-1處理RAW264.7細(xì)胞,結(jié)果顯示,VCAM-1可明顯增加RAW264.7細(xì)胞遷移和活化。此外,用抗VCAM-1抗體阻斷VSMCs膜表面的VCAM-1后,觀察其與RAW264.7細(xì)胞的相互作用。粘附分析顯示,兩種細(xì)胞的粘附明顯減少(P0.01)。結(jié)果表明,SM22α缺失的VSMCs通過上調(diào)VCAM-1實(shí)現(xiàn)對(duì)巨噬細(xì)胞的募集和活化。3.4敲除SM22α促進(jìn)皮層F-actin與VCAM-1的結(jié)合和VCAM-1膜定位已知SM22α參與actin細(xì)胞骨架重構(gòu),下調(diào)SM22α可促進(jìn)胞漿F-actin解聚和皮層區(qū)F-actin聚合。為了探討actin細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)是否參與VCAM-1細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位,通過免疫共沉淀檢測二者的相互作用。結(jié)果顯示,SM22α缺失促進(jìn)細(xì)胞VCAM-1與F-actin的相互作用。雙熒光染色細(xì)胞骨架和VCAM-1,結(jié)果顯示,VCAM-1與皮層區(qū)F-actin共定位。用細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑JPK預(yù)處理VSMCs后,F-actin與VCAM-1相互作用減弱,皮層區(qū)共定位明顯減少。表明SM22α缺失通過調(diào)節(jié)actin細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)而促進(jìn)VCAM-1膜定位。結(jié)論:1 SM22α缺陷促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤形成。2 敲除SM22α促進(jìn)血管中膜巨噬細(xì)胞浸潤和活化。3 SM22α缺失促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞VCAM-1表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R543.16

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Franck Verrecchia;Alain Mauviel;;Transforming growth factor-β and fibrosis[J];World Journal of Gastroenterology;2007年22期

，

本文編號(hào)：1647375