本文選題：三氟拉嗪　切入點：系膜細胞　出處：《山西醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：系膜細胞異常增殖將引起細胞外基質(zhì)的增多,導致腎小球硬化,多數(shù)患者甚至將不可逆的進展為終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)。因此,抑制系膜細胞的過度增殖成為增生性腎小球疾病的治療靶點。本課題組從2010年開始研究了三氟拉嗪對人系膜細胞的體外作用效果及相關(guān)機制,同時觀察了三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)對狼瘡腎小鼠體內(nèi)系膜細胞的作用效果及機制,并進一步研究了三氟拉嗪聯(lián)合環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)對系膜增生性疾病的治療效果。第一部分三氟拉嗪抑制體外和體內(nèi)系膜細胞的異常增殖目的:研究三氟拉嗪對體內(nèi)外系膜細胞增殖的影響。方法:(1)體外實驗采用MTT、臺盼藍細胞計數(shù)法檢測各組細胞增殖的情況。(2)體內(nèi)實驗HE、PAS、MASSON染色后觀察各組腎臟系膜細胞增生情況;免疫組化和Western Blotting方法檢測各組Ki67和細胞增殖核抗原(PCNA)的表達;采用ELISA方法檢測各組動物血肌酐,尿素氮水平,比較各組小鼠腎功能的情況。結(jié)果:(1)體外實驗MTT結(jié)果顯示,高濃度的血清即20%FBS組可以刺激系膜細胞的過度增殖,該效應呈時間和劑量依賴性。TFP處理后,細胞增殖能力顯著下降,且該效應呈劑量及時間依賴性;(2)體內(nèi)實驗HE,PAS和MASSON染色結(jié)果顯示,狼瘡性腎炎組(Lupus Nephritis,LN)小鼠較正常組(Normal,N)有明顯的病理改變,實驗組(ln+tfp)較ln組系膜細胞增生程度減低。這一結(jié)果也在ki67和pcna的免疫組化及westernblotting的研究中得到了驗證。elisa結(jié)果顯示,ln組血肌酐,尿素氮水平明顯高于normal組,給藥tfp后兩組水平均降低。結(jié)論:三氟拉嗪可以抑制體內(nèi)外系膜細胞的異常增殖,并可以改善系膜增生性狼瘡腎小鼠的腎功能。第二部分三氟拉嗪對系膜細胞細胞周期的影響及機制的研究目的:探討三氟拉嗪對系膜細胞細胞周期的影響及機制。方法:(1)體外實驗通過流式細胞儀檢測各組細胞的周期分布,然后根據(jù)此流式分析結(jié)果,通過westernblotting方法考察相關(guān)周期蛋白的變化。(2)體內(nèi)實驗采用westernblotting方法進一步驗證tfp在體內(nèi)對細胞周期蛋白表達的影響。免疫組化方法檢測cyclind1在各組的表達情況。結(jié)果:(1)體外實驗流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,相較于正常系膜細胞組(n組),20%fbs促進了系膜細胞由g0/g1期逐漸向s期轉(zhuǎn)變,給藥后,g0/g1期的細胞百分比逐漸增加,相應地s期的細胞漸減,該效應具有劑量依賴性;westernblotting結(jié)果證明,三氟拉嗪抑制cyclind1,cdk2,cdk4蛋白的表達,促進p21蛋白的表達,而對cycline,cdk6,p27蛋白表達影響不大。(2)體內(nèi)實驗westernblotting結(jié)果與體外結(jié)果實驗一致。進一步,通過免疫組化結(jié)果可觀察到,狼瘡腎組(ln)cyclind1表達較正常小鼠增高,給藥tfp后其表達下降,差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論:三氟拉嗪可以阻斷體外異常增殖的人系膜細胞由g0/g1期進入s期,這可能與它可以抑制cyclind1,cdk2,cdk4蛋白的表達及促進p21蛋白的表達相關(guān)。第三部分三氟拉嗪促進系膜細胞的凋亡的研究目的:探討三氟拉嗪對系膜細胞細胞凋亡的的影響及機制方法:(1)體外實驗:流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況,westernblotting,realtimepcr方法分析bcl-2及bax的表達變化。(2)體內(nèi)實驗:動物實驗分組情況同第一部分。分別采用westernblotting和免疫組化方法檢查各組bcl-2及bax的表達變化。結(jié)果:(1)體外實驗結(jié)果流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:與n組(normal組)相比較,con組(control組,20%組)凋亡細胞比例明顯偏低。加三氟拉嗪干預24小時后,與con組比較凋亡細胞比率明顯增加。realtimepcr結(jié)果顯示:與n相比較,con組baxmrna的表達量較低,而bcl-2mrna的表達量較高。三氟拉嗪給藥干預24小時后,我們可以看到與con組比較,給藥組con+tfpbaxmrna的表達量顯著增高,而bcl-2mrna的表達量顯著降低。westernblotting所監(jiān)測蛋白水平的變化與基因水平變化相一致。(2)體內(nèi)實驗結(jié)果免疫組化方法結(jié)果顯示:通過鏡下棕色顆粒的光密度分析,與n組(normal組)小鼠相比較,ln組(狼瘡腎)bax蛋白的表達量較高,而bcl-2蛋白的表達量也增加。三氟拉嗪灌胃給藥干預3個月后,bax蛋白的表達量顯著升高,而bcl-2蛋白的表達量顯著降低。進一步比較三組bax與bcl-2的比值(bax/bcl-2ratio),可以看到ln組較n組低。westernblotting所監(jiān)測蛋白水平的變化與免疫組化結(jié)果相一致。結(jié)論:三氟拉嗪可以促進系膜細胞的凋亡,是因為它可以下調(diào)bcl-2水平的表達,同時上調(diào)bax的表達。第四部分三氟拉嗪通過p-jnk及p-akt通路影響細胞的周期和凋亡目的:進一步研究三氟拉嗪抑制系膜細胞增殖的機制,以及其對信號轉(zhuǎn)導通路p13k/akt,mapk/jnk和mapk/erk1/2的影響。方法:采用westernblotting方法分析tfp對信號轉(zhuǎn)導通路蛋白p-akt/akt,p-erk/erk,p-jnk/jnk表達水平的影響。結(jié)果:實驗一westernblotting結(jié)果表明,與正常細胞對照組(normal)相比,20%fbs組可以增加p-jnk,p-akt,p-erk蛋白的表達。給藥tfp后,p-jnk,p-akt的表達下調(diào),這種效應具有劑量依賴性,而各種濃度的tfp對p-erk蛋白蛋白的表達均無影響。實驗二westernblotting結(jié)果表明,與normal組相比,pdgf刺激后可以增加p-jnk,p-akt,p-erk蛋白的表達。tfp20μm處理后,p-jnk,p-akt的表達下調(diào),但p-erk蛋白的表達變化不明顯。結(jié)論:三氟拉嗪可能通過抑制jnk/mapk及akt/pi3k通路影響系膜細胞的周期和凋亡,而不影響erk/mapk通路。第五部分三氟拉嗪聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療狼瘡性小鼠的實驗研究目的:明確與使用單種藥相比,三氟拉嗪與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用可以更好地抑制狼瘡腎小鼠系膜細胞的增殖,以及觀察其對狼瘡腎小鼠肝、腎功能的影響。方法:HE、PAS染色后觀察各組腎臟系膜細胞增生情況;Western Blotting方法檢測各組Ki67和PCNA的表達;ELISA方法檢測各組動物血肌酐,尿素氮,谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平,比較各組小鼠腎功能的情況。結(jié)果:HE和PAS染色實驗結(jié)果顯示,正常小鼠組(N)小鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常;狼瘡腎組(LN)小鼠有明顯系膜細胞增生;狼瘡腎+三氟拉嗪組(LN+TFP)、狼瘡腎+環(huán)磷酰胺組(LN+CTX)較LN組細胞增生有所減輕;狼瘡腎+三氟拉嗪+環(huán)磷酰胺聯(lián)合減量用藥組(LN+1/2TFP+1/2CTX)與LN組相比,系膜細胞增生程度進一步下降,該實驗可從Ki67和PCNA的Western Blotting,免疫組化等結(jié)果進一步佐證。ELISA研究結(jié)果表明,LN組,LN+TFP組、LN+CTX組、LN+1/2TFP+1/2CTX較N組AST水平上升。與LN組相比,LN+TFP組,LN+1/2TFP+1/2CTX組AST水平無明顯差異,而LN+CTX組顯著增高。研究還發(fā)現(xiàn),LN+1/2TFP+1/2CTX組較LN+CTX組AST水平顯著降低。結(jié)論:三氟拉嗪與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用并且劑量減半,可以更好地抑制狼瘡腎小鼠系膜細胞的增殖并改善腎功能;三氟拉嗪對肝損傷作用小,與環(huán)磷酰胺減半聯(lián)合使用不良反應更少。
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【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R692

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本文編號：1641983