本文選題：Car6-b　切入點(diǎn)：IL-12　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：正常的免疫應(yīng)答反應(yīng)對(duì)于機(jī)體的自我保護(hù)至關(guān)重要。機(jī)體通過(guò)天然免疫應(yīng)答識(shí)別入侵病原體(病毒、細(xì)菌及真菌)或者細(xì)胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)模式分子,激活細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)在內(nèi)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)及后期的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。這個(gè)免疫應(yīng)答過(guò)程由許多免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子共同參與。在參與免疫應(yīng)答反應(yīng)的多種分子中,白細(xì)胞介素12(interleukin 12,IL-12)是一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子,它主要由活化的巨噬細(xì)胞(macrophages)和樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)產(chǎn)生,并進(jìn)一步誘導(dǎo)Th1輔助性淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer cells,NK cells)分泌干擾素γ(interferon γ,IFN-γ),從而保護(hù)機(jī)體抵抗病原體感染,特別是胞內(nèi)細(xì)菌的感染。由此可見,IL-12通過(guò)其自身作用將機(jī)體天然免疫屏障和后續(xù)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答相互關(guān)聯(lián),是天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁分子。IL-12由IL-12p35和IL-12p40兩個(gè)亞基組成。IL-12家族共有3個(gè)成員,除了IL-12之外,另一個(gè)成員是白細(xì)胞介素23(interleukin 23,IL-23),由與IL-12有相同的亞基IL-12p40和IL-23p19組成;還有一個(gè)成員是白細(xì)胞介素27(interleukin 27,IL-27),由 EB 病毒誘導(dǎo)基因 3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)和 IL-27p28組成。IL-12在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,然而,有關(guān)IL-12表達(dá)調(diào)控的機(jī)制目前尚未完全闡明。我們通過(guò)本研究首次表明IL-12可以被碳酸酐酶6B(carbonic anhydrase6Btype,Car6-b,編碼 CA-VIB)調(diào)控表達(dá)的新機(jī)制。E-selectin(由Sele編碼)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附因子,介導(dǎo)白細(xì)胞的粘附和遷移。我們?cè)谇捌谘芯抗ぷ靼l(fā)現(xiàn)E-selectin不僅介導(dǎo)白細(xì)胞的游出,還通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞中干擾素γ受體β亞基(IFNγR2)在細(xì)胞膜的表達(dá),參與巨噬細(xì)胞的活化過(guò)程。我們通過(guò)對(duì)Sele敲除小鼠(SelS-/-)和對(duì)照組小鼠(Sele+/+)腹腔注射李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)后,取體內(nèi)刺激第三天的腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行芯片分析發(fā)現(xiàn),Car6在Sel-/-腹腔巨噬細(xì)胞中的表達(dá)顯著下降,因此提示Caar6在天然免疫反應(yīng)中可能具有一定的功能。碳酸酐酶(carbonicanhydrases,CAs)廣泛存在于哺乳動(dòng)物中,屬于a-碳酸酐酶。CAs是含鋅離子(Zn2+)的金屬酶,可以催化二氧化碳(carbon dioxide)發(fā)生水合反應(yīng),對(duì)于pH調(diào)控和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。目前,鑒定出13種具有碳酸酐酶活性的同工酶,其中,只有CA-Ⅵ是分泌型表達(dá)的碳酸酐酶,分泌到唾液和乳汁中。CA-Ⅵ蛋白有兩種亞型:一種是分泌型的A型Car6(Car6-a,編碼CA-VⅥA),另一種是定位在細(xì)胞內(nèi)的B型Car6(Car6-b,編碼CA-ⅥB)。目前為止,該家族成員是否參與天然免疫應(yīng)答反應(yīng)尚沒(méi)有報(bào)道。我們首先對(duì)Car6在免疫細(xì)胞中的表達(dá)譜進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)只有Car6-b表達(dá)在免疫細(xì)胞中,特別是在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。為了進(jìn)一步研究Car6-b在天然免疫反應(yīng)中的作用,我們首先在體外培養(yǎng)的原代巨噬細(xì)胞中使用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)Car6-b的表達(dá),之后分別用李斯特菌或者脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激,發(fā)現(xiàn)IL-12的表達(dá)量在Car6-b下調(diào)表達(dá)后的細(xì)胞內(nèi)顯著降低。我們隨后用CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9)體系構(gòu)建Car6敲除的小鼠,通過(guò)體內(nèi)感染李斯特菌模型,發(fā)現(xiàn)Car6表達(dá)缺失后,IL-12的產(chǎn)生受到顯著抑制,小鼠清除李斯特菌能力也顯著降低,導(dǎo)致Car6敲除小鼠在感染李斯特菌后生存率顯著低于野生型小鼠。我們進(jìn)一步探討了Car6如何特異性調(diào)控IL-12的表達(dá),結(jié)果表明,核定位的CA-VIB通過(guò)與蛋白精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶 5(protein arginine N-methyltransferase 5,PRMT5)相互作用,從而減少Il12啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3第8位精氨酸對(duì)稱性二甲基化(H3R8me2s)修飾,進(jìn)而促進(jìn)Il12啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)的開放狀態(tài),促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子c-Rel與Il12b啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合,最終選擇性促進(jìn)IL-12的表達(dá)。我們的研究揭示了一種全新的IL-12表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,即碳酸酐酶6B可以通過(guò)與PRMT5相互作用以表觀修飾的機(jī)制促進(jìn)IL-12的表達(dá)。這一結(jié)果首次提出了Car6-b在天然免疫中發(fā)揮促進(jìn)作用,為感染性疾病的研究和治療提供新的潛在靶點(diǎn)和研究思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1637528