本文選題：基質(zhì)金屬蛋白酶　切入點(diǎn)：基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:胃食管交界腺癌(adenocarcinoma of esophagogastric junction,AEG)是一種來源于食管遠(yuǎn)端和胃食管交界處的惡性腫瘤,病死率極高,近年來發(fā)病率在全球急劇攀升。盡管內(nèi)鏡篩查手段普及以及多種治療手段不斷更新,胃食管交界腺癌的預(yù)后仍然較差,5年生存率約15%-20%。由于位置特殊,胃食管交界腺癌的歸屬胃癌或食管癌仍有較大爭議。1996年Siewert嘗試以一種標(biāo)準(zhǔn)化的分類系統(tǒng)解決這一爭議性的問題,在解剖標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,將該腫瘤予以分類,這些腫瘤必須均侵及胃食管交界處(esophagogastric junction,EGJ)。腫瘤中心位于EGJ以上1-5cm為Ⅰ型,腫瘤中心位于EGJ以上1cm至EGJ下2cm以內(nèi)為Ⅱ型,而腫瘤位于EGJ下2-5cm為Ⅲ型。顯然,Ⅰ型AEG代表遠(yuǎn)端食管癌,Ⅱ型為賁門癌,而Ⅲ型則為賁門周圍癌。Barrett食管和食管癌已被證明有比較確定的關(guān)系,由于位于食管下端,Ⅰ型AEGs與Barrett食管密切相關(guān),其中80%Ⅰ型AEGs手術(shù)切除標(biāo)本表現(xiàn)為腸上皮化生。相反地,Barrett食管相關(guān)腸上皮化生分別見于僅5.6%-8%的Ⅱ型和Ⅲ型AEGs腫瘤患者。而且,在不同人群中,各型腫瘤所占比例有所不同;Ⅱ型和Ⅲ型AEGs腫瘤患者在東方國家發(fā)病率較歐美國家高,這種發(fā)病率的差異可能與西方國家食管癌發(fā)病率增加有關(guān)。在美國,26年來,白種男性食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)發(fā)病率增加 400%,而白種女性增加 300%。在同一研究中,非洲裔美國男性EAC發(fā)病率升高100%,然而鱗癌的發(fā)病率卻無明顯變化。1992年至1998年,Kubo and Corely流行病學(xué)研究最終結(jié)果表明食管癌發(fā)病率上升,而這期間賁門癌發(fā)病率穩(wěn)定。其他有研究表明Ⅱ型和Ⅲ型AEGs發(fā)病率略有增加。結(jié)合西方國家遠(yuǎn)端胃癌發(fā)病率陡降的數(shù)據(jù),以上流行病學(xué)證據(jù)表明AEGs代表了一種區(qū)別于EAC、遠(yuǎn)端胃癌以及食管鱗癌的異質(zhì)性腫瘤。在美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第七版分級手冊問世之前,AEGs既可以通過食管癌系統(tǒng)分級,亦可應(yīng)用胃癌分級標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致分級混亂,影響其標(biāo)準(zhǔn)化治療。因此,第七版分級手冊致力于解決這一問題,運(yùn)用食管癌分級系統(tǒng)對AEGs進(jìn)行分級。典型的食管癌分級流程包括:胸部、腹部及盆腔聯(lián)合計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed Tomography,CT)/正電子發(fā)射成像(positron emission tomography,PET)以及內(nèi)鏡超聲檢查。多個(gè)研究表明R0切除仍是AEGs患者獲得長期生存的重要預(yù)后預(yù)測因素。因此,外科治療首要治療目標(biāo)在于徹底切除腫瘤以及相鄰腸上皮化生組織,并足夠范圍的淋巴結(jié)清掃。如果術(shù)前懷疑無法行根治性切除,則應(yīng)考慮新輔助化療。無論進(jìn)行任何手術(shù),應(yīng)當(dāng)于術(shù)前充分考慮并改善患者的功能和生理狀態(tài),使其達(dá)到理想狀態(tài)。雖然根治性手術(shù)治療是影響AEGs患者預(yù)后的主要因素,但由于AEGs在診斷時(shí)多已發(fā)生廣泛局部侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,僅有11%-%21的AEGs患者可行根治性切除治療,雖然化療和/或放射性治療可起到輔助性治療作用,但70%患者術(shù)后仍出現(xiàn)全身性復(fù)發(fā),因此,對于AEGs尋找腫瘤標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn)尤為重要。AEGs發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜,且受多種通路共同調(diào)控,由于調(diào)控機(jī)制多樣,缺少理想的干預(yù)藥物,而腫瘤播散是一個(gè)多步驟的過程,其中細(xì)胞外基質(zhì)的破壞和腫瘤細(xì)胞周圍結(jié)締組織的降解至關(guān)重要。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一個(gè)鋅依賴性的肽鏈內(nèi)切酶家族,參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解,從而促進(jìn)腫瘤的侵襲及播散。在MMPs家族中,MMP-9和MMP-2是明膠酶,可降解基質(zhì)內(nèi)的ⅣV型膠原和明膠。文獻(xiàn)顯示MMP2和/或MMP9與食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。但是,以往研究主要是基于食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC),而這種結(jié)論是否適用于不同病理類型的胃食管交界腫瘤仍有爭議。組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)可抑制MMPs的生物學(xué)活性,因此其被推測可阻止腫瘤生長、局部侵潤及轉(zhuǎn)移。但是相反,報(bào)道表明TIMPs又可以刺激生長及抗凋亡的方式促進(jìn)腫瘤發(fā)生。至今,尚缺乏關(guān)于TIMPs在人類AEG中的臨床意義的研究。因此,本研究旨在通過檢測MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2在胃食管交界腺癌及正常組織中的表達(dá),探討其表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,首次闡明了 MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2在不同病理類型的胃食管交界腺癌中的表達(dá)變化及作用。第一部分MMP-9、MMP-2、TIMP-1和TIMP-2在胃食管交界腺癌中的臨床病理研究研究目的:1、研究MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2表達(dá)變化。2、探討MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。3、探討MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。研究方法:一、胃食管交界腺癌組織中MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2表達(dá)變化1.患者病理標(biāo)本獲取及病理切片制作通過查閱病歷記錄收集詳細(xì)的臨床及病理資料,獲得對應(yīng)腫瘤組織石蠟包塊及癌旁組織標(biāo)本,并進(jìn)行病理切片。2.MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2在腫瘤及正常組織中的表達(dá)分布情況采用免疫組織化學(xué)染色法(immunohistochemical method)檢測MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2在腫瘤及正常組織中的表達(dá)分布情況。結(jié)果通過計(jì)算染色組織切片Rajkumar得分進(jìn)行分析。二、統(tǒng)計(jì)分析MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。1.分析MMP-9及其抑制劑TIMP-1表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。2.分析MMP-2及其抑制劑TIMP-2表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。三、統(tǒng)計(jì)分析MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。1.分析MMP-9及其抑制劑TIMP-1表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。2.分析MMP-2及其抑制劑TIMP-2表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:一、胃食管交界腺癌組織中MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2表達(dá)變化1.患者病理標(biāo)本獲取及病理切片制作本研究納入了山東大學(xué)附屬濟(jì)南中心醫(yī)院2006年至2012年之間行外科根治性手術(shù)的79例AEGs病人,其中男性40例,女性39例。隨訪病例70例,隨訪時(shí)間2-62月。通過查閱病歷記錄收集詳細(xì)的臨床及病理參數(shù)資料,并成功獲取了患者癌組織及癌周組織標(biāo)本,順利制作病理切片。2.MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2在腫瘤及正常組織中的表達(dá)分布情況通過免疫組織化學(xué)染色法(immunohistochemicalmethod),我們發(fā)現(xiàn)MMP-9和MMP-2陽性染色位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜。TIMP-1和TIMP-2陽性染色位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和周圍基質(zhì)細(xì)胞(圖1)。在79例AEGs患者腫瘤組織中,MMP-9、MMP-2、TIMP-1 和 T1MP-2 分別于 52 例(65%),42 例(53%),56 例(70%),39例(49%)患者中高表達(dá)。二、統(tǒng)計(jì)分析MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。1.分析MMP-9及其抑制劑TIMP-1表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。本研究中,MMP-9表達(dá)與組織分化差(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)及UICC分級(P=0.008)有關(guān),但與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤侵潤深度無關(guān)。然而,TIMP-1表達(dá)水平與組織分化程度(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)及UICC分級(P=0.008)呈負(fù)有關(guān)(表1)。2.分析MMP-2及其抑制劑TIMP-2表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。本研究并未發(fā)現(xiàn)MMP-2和TIMP-2與病人臨床病理參數(shù)有顯著性聯(lián)系(表1)。三、統(tǒng)計(jì)分析MMP-9和MMP-2及其抑制劑TIMP-1和TIMP-2表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。1.分析MMP-9及其抑制劑TIMP-1表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。單因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)及腫瘤浸潤深度(P= 0.05)與總體生存時(shí)間顯著相關(guān)。MMP-9和TIMP-1表達(dá)與總體生存率有關(guān),但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.082和P=0.056)。在MMP-9+/TIMP-亞組中,平均生存時(shí)間為10.5月,相比其他表型組的平均生存時(shí)間35月,其差異與總體生存時(shí)間顯著相關(guān)(P0.001)(表2)值得注意的是,多因素分析表明,MMP-9+/TIMP-表型與患者預(yù)后相關(guān)(HR(95%CI):2.263(1.468-2.574),P=0.038)。(表 3)2.分析MMP-2及其抑制劑TIMP-2表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。本研究并未發(fā)現(xiàn)MMP-2和TIMP-2與病人患者預(yù)后有顯著性聯(lián)系(表1)結(jié)論與創(chuàng)新性:1、MMP-9表達(dá)與組織分化差(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)及UICC分級(P=0.008)有關(guān);2、TIMP-1表達(dá)水平與組織分化程度(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)及UICC分級(P=0.008)呈負(fù)有關(guān);3、單因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)及腫瘤浸潤深度(P= 0.05)與總體生存時(shí)間顯著相關(guān)。4、MMP-9+/TIMP-表型與患者預(yù)后相關(guān)(HR(95%CI):2.263(1.468-2.574),P=0.038)。第二部分:TIMP1對食管腺癌細(xì)胞功能的影響及機(jī)制研究目的:本實(shí)驗(yàn)通過研究TIMP1對食管腺癌細(xì)胞株增殖能力、遷移能力和浸潤能力的影響,進(jìn)一步探討其對細(xì)胞功能影響的可能機(jī)制。方法:1.TIMP1基因表達(dá)調(diào)節(jié):分別通過合成TIMP1的siRNA干擾片段下調(diào)TIMP1的基因表達(dá),過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)基因表達(dá)設(shè)計(jì)TIMP1的siRNA干擾片段序列,并由上海凱基公司合成。過表達(dá)載體GV135-TIMP1由吉?jiǎng)P生物公司合成并進(jìn)行腺病毒包裝。2.調(diào)節(jié)TIMP1表達(dá)后,行食管腺癌細(xì)胞株功能學(xué)檢測(增殖、遷移和浸潤能力)siRNA 干擾 TIMP1 表達(dá)實(shí)驗(yàn),分組:MOCK(Lipofectamine)組,NC(Lipofectamine+ScramblesiRNA)組 和siRNA-TIMP1(Lipofectamine+siRNA-TIMP1)組。TIMP1 過表達(dá)分組:對照組、TIMP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空載體組。(1)將細(xì)胞分別接種于96孔板中,并于Oh、24h、48h、72h時(shí)通過MTS法檢測細(xì)胞增殖率。(2)接種上述各組細(xì)胞于12孔板中,均勻劃痕,分別于6h、24h和48h觀察不同處理組間劃痕間距的變化。(3)處理24h后,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Transwell小室中培養(yǎng)6h,分別計(jì)數(shù)干擾后穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果:1.分別利用雙酶切和測序方法行重組質(zhì)粒鑒定,結(jié)果顯示重組質(zhì)粒基因序列與目的基因一致。2.siRNA-TIMP1干擾TIMP1表達(dá),增加食管腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)其表達(dá)則出現(xiàn)相反變化。MTS結(jié)果顯示:在SEG1人食管腺癌細(xì)胞中干擾TIMP1后,細(xì)胞增殖水平升高(P0.05);而過表達(dá)TIMP1后SEG1細(xì)胞的增殖水平下降(P0.05),各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示干擾TIMP1表達(dá)后,SEG1細(xì)胞愈合能力較NC和MOCK組增強(qiáng)。Transwell結(jié)果顯示:干擾TIMP1后穿過小室基底膜的SEG1細(xì)胞數(shù)量最多,較NC和MOCK組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而過表達(dá)TIMP1后,穿過基底膜的SEG1細(xì)胞數(shù)目最少,較正常對照組和空載體組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:TIMP1在食管腺癌中具有重要作用,干擾TIMP1的表達(dá)增加了食管腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力;上調(diào)TIMP1表達(dá)后,細(xì)胞增殖和侵襲能力下降。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735

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