本文選題：TAK1抑制劑　切入點：化療　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：隨著對乳腺癌認(rèn)識的不斷加深,目前認(rèn)為乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病。不同乳腺癌類型具有不同的基因背景,不同的生物學(xué)行為,不同的形態(tài)學(xué)表現(xiàn),以及不同的臨床轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。世界范圍內(nèi),乳腺癌在女性中的發(fā)病率是22%,而在西方國家這個比例甚至更高,達到所有女性中的26%。從而使乳腺癌成為女性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤。在北美,歐洲以及澳大利亞等發(fā)達國家的人口中,大約有6%的女性會在75歲之前診斷為浸潤性乳腺癌。但隨著局部治療的逐漸完善以及系統(tǒng)性全身治療的結(jié)合乳腺癌的死亡率在西方社會呈逐年下降的趨勢。其中針對不同的乳腺癌類型的特異性的治療方式明顯的改善了患者的生存期。這其中包括針對雌激素及孕激素受體陽性的患者所給予的內(nèi)分泌治療,同樣包括針對人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor2,HER-2)陽性的患者基于的抗HER-2靶向治療使一部分患者在總生存和無病生存方面獲得收益。雖然特異性較高的靶向治療在乳腺癌的治療中發(fā)揮了重要的作用,但是,對于進展期乳腺癌,尤其是預(yù)后較差的三陰性乳腺癌來說,全身系統(tǒng)性的化療任然是這部分乳腺癌患者治療的基石。其中阿霉素作為一種全身性的化療藥物,在乳腺癌的治療中應(yīng)用廣泛。在2016年的NCCN乳腺癌治療指南中,含有阿霉素的輔助化療方案作為一線的乳腺癌化療方案被推薦用于臨床乳腺癌患者的治療中。尤其是對于預(yù)后較差的HER-2過表達型以及三陰型乳腺癌患者。但是因為阿霉素的進行性的計量依賴性的心臟毒性嚴(yán)重的限制了他的臨床應(yīng)用。臨床上通過應(yīng)用脂質(zhì)體阿霉素以及在應(yīng)用阿霉素時加用心臟保護藥物如右丙亞胺從而來降低阿霉素的心臟毒性。取得了有限的臨床效果。因此為了獲得更好的治療效果,找到新的方法來降低阿霉素的心臟毒性,從而增加阿霉素的治療效果是十分迫切的。TAK1是在1995年首先被發(fā)現(xiàn)的,他是線粒體激活蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K)家族的成員之一,可以被TGF-β和骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)激活。最近的研究表明,TAK1可以通過激活I(lǐng)KK-NF-k B通路發(fā)揮比較強大的促進增值的作用。除此之外,TAK1還可以通過磷酸化的方式激活MAPKKs,從而導(dǎo)致MAPKs的激活,包括ERK,p38和JNK。NF-k B和MAPKs的激活會誘導(dǎo)下游炎癥因子和抗凋亡蛋白的表達,從而對細(xì)胞起到抗凋亡和促進增值的作用。更進一步有研究發(fā)現(xiàn)增高的NF-k B活性可以使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生對化療,內(nèi)分泌治療以及放療的抗性。由于TAK1在癌癥發(fā)展以及腫瘤耐藥的產(chǎn)生中發(fā)揮重要的作用,因此針對TAK1作為一個可行的治療靶點的研究在不同的惡性腫瘤中都得到了廣泛的開展。目前在胰腺癌,乳腺癌,結(jié)腸癌以及非小細(xì)胞肺癌中都有針對TAK1作為治療靶點的研究。在以往的研究中我們發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞在遇到一些基因毒性藥物的殺傷時,會啟動本身的NF-k B通路,上調(diào)NF-k B通路的活性,來抵抗基因毒性藥物的殺傷。而在NF-k B通路激活的過程中,TAK1作為這條通路激活的一個介導(dǎo)分子,發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用。因此有研究者應(yīng)用TAK1的抑制劑5Z-7-oxozeaenol(5Z-7)來增強阿霉素在神精母細(xì)胞瘤中的治療作用。5Z-7是一種不可逆的ATP競爭性TAK1抑制劑,主要由真菌分泌提純而成,獲得相對困難,因此價格比較昂貴。這就限制了5Z-7作為一種藥物應(yīng)用于臨床的可能性。最近的研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌當(dāng)中5Z-7同樣可以抑制TAK1的活性,從而導(dǎo)致下游的分子活性受抑制,包括p38,IKK等。更進一步的體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn),通過敲除TAK1相關(guān)性分子1(TAK1-associated molecule 1,TAB1)能夠抑制TAK1的活性,從而明顯的抑制了乳腺腫瘤細(xì)胞在實驗動物體內(nèi)的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。基于以上的研究結(jié)果我們推斷,通過抑制TAK1的活性應(yīng)該可以增強阿霉素對于乳腺癌的細(xì)胞毒性作用。NG25是一種人工合成的2型TAK1抑制劑,他能夠結(jié)合到目標(biāo)激酶的ATP結(jié)合位點上,從而達到抑制TAK1活性的作用。與5Z-7相比,NG25最大的優(yōu)勢在于他的價格比較廉價,比較容易獲得。相比于5Z-7可能具有更大的臨床應(yīng)用前景。最近有多個研究都證明了NG25能夠有效的抑制TAK1的活性。這些研究主要是針對在炎癥的過程中來探討NG25對于TAK1的抑制作用,然而對于NG25的活性,還沒有學(xué)者在腫瘤中進行驗證。在我們這個基礎(chǔ)研究中,我們應(yīng)用了多個乳腺癌細(xì)胞系來驗證NG25的細(xì)胞毒性作用,同時進一步探討了在乳腺癌中NG25對于阿霉素細(xì)胞毒性的增強作用。我們應(yīng)用的乳腺癌細(xì)胞系包括不同的乳腺癌類型,主要包括了HER-2過表達及三陰型這兩個預(yù)后最差的乳腺癌類型。TAK1是一種細(xì)胞內(nèi)錨分子,他同時調(diào)節(jié)NF-k B通路和MAPK通路。在細(xì)胞生存中起著非常重要的作用,同時還能促進腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和抗藥性的產(chǎn)生。前期有部分學(xué)者的研究工作顯示,TAK1可能是一個比較有前景的腫瘤治療的靶點。在胰腺癌的治療研究中,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾技術(shù)沉默TAK1或者是通過口服TAK1的抑制劑LYTAK1能夠增強奧沙利鉑和吉西他濱的細(xì)胞殺傷作用,從而增強這兩個化療藥物在體外實驗中對胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。同樣也有研究者發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中通過抑制TAK1的活性能夠增加拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的活性。此外,有研究者應(yīng)用TAK1的抑制劑5Z-7來增強阿霉素和依托泊苷在神精母細(xì)胞瘤中的細(xì)胞毒性作用。5Z-7是一種從真菌中分離出來的TAK1一直劑,價格昂貴獲得比較困難。更進一步,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在KRAS依賴性的結(jié)腸癌中,通過抑制TAK1具有一定的促進腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。那么關(guān)于TAK1的最新的研究發(fā)現(xiàn),研究中通過應(yīng)用微小RNA-26b抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)TAK1和TAB3的活性,降低了腫瘤細(xì)胞中NF-k B的活性,從而增強了肝癌細(xì)胞的化療敏感性。這些研究都顯示了TAK1作為多種惡性腫瘤的治療靶點的可行性以及相應(yīng)的應(yīng)用前景。與上述的研究結(jié)果一致,我們的研究發(fā)現(xiàn),通過應(yīng)用一種人工合成的TAK1抑制劑NG25,能夠增加乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。這種所用是通過降低NF-k B通路的活性而發(fā)揮的作用。因此在我們的研究中,通過應(yīng)用多個成熟的乳腺癌細(xì)胞系我們證明了NG25能夠抑制TAK1的活性,從而增強阿霉素誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的凋亡。這個研究中所應(yīng)用的乳腺癌細(xì)胞系涵蓋了不同的乳腺癌的分子亞型,所得出的實驗結(jié)果具有一定的代表性和普遍性。因此具有較大的使用價值。在本研究中,選取了五種乳腺癌細(xì)胞株,包括MDA-MB-231和BT549代表了三陰性乳腺癌、還有MCF7和T-47D代表了激素受體陽性的乳腺癌,另外還有HCC-1954代表了HER-2過表達的乳腺癌。NF-k B是一個關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,具有多樣的生物學(xué)活性,增加細(xì)胞活性、增加腫瘤細(xì)胞對各種治療的抗性、增加腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。因此NFk B在各種腫瘤中都得到了廣泛的研究。NF-k B可以被多種刺激因素激活,包括各種應(yīng)激以及對腫瘤細(xì)胞基因組的各種損傷因素。阿霉素作為一種化療藥物在多種惡性腫瘤的治療中都得到廣泛的應(yīng)用。他主要的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機制主要有兩個方面。第一阿霉素可以通過干擾DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞走向凋亡,另外一方面阿霉素可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的DNA雙鏈破裂,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的DNA發(fā)生不可逆的損傷從而達到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。在這種情況下,腫瘤細(xì)胞的NF-k B通路會被激活,激活的NF-k B會通過作用于ATM、腫瘤抑制基因和乳腺癌易感基因2(breast cancer susceptibility gene 2,BRCA2)來達到腫瘤細(xì)胞損傷DNA的自我修復(fù)。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)NG25能夠抑制阿霉素引起的NF-k B通路的激活。從而抑制NF-k B激活后所介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的自我修復(fù)。達到增強阿霉素對乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用的目的。在研究中我們通過檢測Ik Bα的水平證實了NG25能夠通過抑制TAK1的活性來抑制NF-k B通路的激活。而這個潛在的機制可能是NG25在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)活性的主要機制。除此之外,我們同樣檢測到TAK1介導(dǎo)的MAPK通路的激活也可以被NG25部分阻斷,乳腺癌中MAPK通路的部分阻斷在NG25發(fā)揮藥物活性的過程中也可能起到一定的作用。綜上所述,通過實驗研究的總結(jié),我們得出結(jié)論,TAK1的激酶活性可以被NG25阻斷,從而降低NF-k B通路以及MAPK通路的活性,最終增加阿霉素在乳腺癌治療中的藥物療效。在乳腺癌細(xì)胞的體外實驗中,阿霉素聯(lián)合NG25可以增強阿霉素化療效果,從而降低阿霉素在化療過程中的藥物劑量而達到降低藥物副作用的目的。隨著乳腺癌臨床以及基礎(chǔ)研究的不斷加深,人們對乳腺癌的認(rèn)識趨于成熟。現(xiàn)在的主流觀點認(rèn)為乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病,目前臨床上主要分為4個主要的分子亞型。包括腔面A型(Luminal A)、腔面B型(Luminal B)、HER-2過表達型(HER-2 positive)和三陰型(triple negative)。每一種亞型都有特異的基因水平的分子改變,從而導(dǎo)致不同的生物學(xué)行為及臨床預(yù)后。但在不同的分子亞型的乳腺癌當(dāng)中,也有一些共同的分子生物學(xué)特點。復(fù)習(xí)文獻我們發(fā)現(xiàn)在多數(shù)的乳腺癌病例中,都可以看到NF-k B通路的持續(xù)性激活,而NFk B通路早已被證明是一個促進腫瘤細(xì)胞存活、增殖的重要通路。更進一步的研究發(fā)現(xiàn),在患者的乳腺癌腫瘤組織中能夠檢測到磷酸化的TAK1表達,證明了TAK1在乳腺癌腫瘤組織中的持續(xù)性表達。進一步的實驗動物的體內(nèi)實驗顯示通過RNAi技術(shù)敲除TAB1來抑制TAK1的活性能夠明顯抑制乳腺癌腫瘤在實驗動物體內(nèi)的增長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。提示診斷乳腺癌來說TAK1很有可能是一個比較有潛力的治療靶點。在我們的研究當(dāng)中,我們發(fā)現(xiàn),NG25SX藥在不同的乳腺癌細(xì)胞系當(dāng)中顯示出了劑量依賴性的細(xì)胞毒性,但是在不同的細(xì)胞系當(dāng)中藥物的效用性略有不同。值得一提的一點是,有研究發(fā)現(xiàn)在侵襲及轉(zhuǎn)移能力較強的三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中,TAK1組成性表達的水平要明顯高于侵襲能力較弱臨床預(yù)后略好的腔面A型的乳腺癌細(xì)胞系MCF7。和上述的研究結(jié)果一致,我們在實驗中發(fā)現(xiàn)NG25對于MDA-MB-231的抑制能力要明顯高于對MCF7抑制能力,這些結(jié)果給我們的提示是,對于具有高度侵襲能力的三陰性乳腺癌來說,TAK1可能更具有價值的治療靶點。通過靶向抑制TAK1的生物活性從而解決腫瘤細(xì)胞的化療耐藥問題已經(jīng)在胰腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌等惡性程度較高的腫瘤中有過嘗試和報道,所得到的也都是陽性結(jié)果。在乳腺癌當(dāng)中,也有學(xué)者通過抑制TAK1的活性來解決腫瘤放射性治療抵抗的問題。在我們的研究中,通過實驗的反復(fù)驗證,有充分的證據(jù)支持在不同的乳腺癌細(xì)胞系當(dāng)中,NG25都能夠增強阿霉素的腫瘤細(xì)胞殺傷作用。這個現(xiàn)象在不同分子亞型的乳腺癌細(xì)胞系中都是一致的。因此,TAK1激酶生物活性的抑制,很可能是一個來客服腫瘤細(xì)胞化療耐藥的治療策略。綜上所述,本研究通過不同人乳腺癌細(xì)胞株研究證明了TAK1抑制劑NG25能夠通過抑制TAK1的活性,抑制阿霉素介導(dǎo)的NF-k B通路和MAPK通路的激活,從而增加阿霉素在不同乳腺癌細(xì)胞系當(dāng)中的腫瘤細(xì)胞殺傷作用。在本研究中我們提供的數(shù)據(jù)足以說明NG25能夠抑制TAK1介導(dǎo)的NF-k B的活化,從而增加阿霉素的化療效果,降低阿霉素的臨床應(yīng)用劑量,減小阿霉素的心臟毒性。因此具有一定的臨床價值,需要進一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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