本文選題：肌萎縮　切入點(diǎn)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景骨骼肌約占人體重量的40%左右,健康的肌肉狀態(tài)不僅是運(yùn)動(dòng)的必要條件,也是人們提高生活質(zhì)量的保障。運(yùn)動(dòng)負(fù)荷可以維持肌肉處于良好狀態(tài),而制動(dòng)會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)負(fù)荷喪失或減少,從而引起肌肉生理、生化及生物力學(xué)等的改變。受制動(dòng)影響最大的肌肉包括比目魚(yú)肌、腓腸肌、股外側(cè)肌等。制動(dòng)引起的廢用性肌萎縮表現(xiàn)為肌纖維體積減少、肌重量降低、肌細(xì)胞大量凋亡、肌纖維縮短。這樣的萎縮多發(fā)生于骨或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、慢性病,或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病以后等。PI3K/Akt/mTOR通路是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵通路,制動(dòng)后肌肉狀態(tài)的恢復(fù)取決于與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的代謝改變是否維持在正氮平衡狀態(tài)。Akt的磷酸化能促進(jìn)肌肉肥大而抑制肌肉萎縮。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)抑制肌細(xì)胞的凋亡能有效減緩制動(dòng)引起的肌萎縮及纖維化過(guò)程�？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax是B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)家族的重要成員,作用分別為抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞凋亡,它們被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的核心調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn),骨骼肌萎縮后大量肌細(xì)胞凋亡并伴隨著凋亡易感基因Bcl-2和Bax表達(dá)的變化,結(jié)果顯示Bcl-2和Bax蛋白參與了肌萎縮的全過(guò)程。肌纖維細(xì)胞屬于成肌分化的最后產(chǎn)物,而一旦肌纖維損傷,機(jī)體的自我修復(fù)過(guò)程需要少量位于肌膜和肌纖維基底膜之間的肌衛(wèi)星細(xì)胞參與。肌纖維損傷后,衛(wèi)星細(xì)胞被激活,分裂增生后形成新的肌纖維或修復(fù)現(xiàn)有的纖維。長(zhǎng)期制動(dòng)能引起肌肉的廢用性萎縮,肌衛(wèi)星細(xì)胞在此過(guò)程中相應(yīng)減少,這可能是與肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖過(guò)程被破壞有關(guān)。此前普遍認(rèn)為肌肉損傷或萎縮后,肌衛(wèi)星細(xì)胞是最佳的移植細(xì)胞�？墒�,研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)肌衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)肌纖維的修復(fù)或重建的影響極其有限。首先,肌衛(wèi)星細(xì)胞隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸減少,它的修復(fù)潛能是有限的。嚴(yán)重的肌營(yíng)養(yǎng)不良,長(zhǎng)期的修復(fù)過(guò)程耗盡了肌衛(wèi)星細(xì)胞,在此過(guò)程中肌纖維逐漸被結(jié)締組織所替代。其次,肌衛(wèi)星細(xì)胞移植后會(huì)出現(xiàn)遷移受限及凋亡問(wèn)題,這極大限制了肌肉修復(fù)及重建的有效性。另外,研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)、增殖肌衛(wèi)星細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致其重建肌肉能力的喪失。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潛能,能促進(jìn)骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪等間充質(zhì)組織的再生。MSCs具有易獲得、易培養(yǎng)、分化、增殖等優(yōu)點(diǎn),越來(lái)越受再生醫(yī)學(xué)的青睞。有文獻(xiàn)報(bào)道,在心臟毒素所導(dǎo)致的肌損傷模型中,MSCs能保護(hù)肌衛(wèi)星細(xì)胞的功能。同時(shí)大鼠骨骼肌缺血性損傷模型也證實(shí)MSCs能有效減少受損肌細(xì)胞的進(jìn)一步凋亡,但MSCs對(duì)制動(dòng)所引起的廢用性肌萎縮中肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和肌細(xì)胞凋亡影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道,仍需要深入研究。研究目的(1)明確MSCs對(duì)制動(dòng)大鼠骨骼肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響,(2)明確MSCs對(duì)制動(dòng)大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響。(3)明確MSCs對(duì)大鼠制動(dòng)后骨骼肌中Akt磷酸化水平的影響研究方法l.MSCs的原代分離培養(yǎng)及純化選取5只6～8周幼齡大鼠麻醉后,無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨剪掉股骨和脛骨的骨骺端,露出骨髓腔,用添加100u/mL青、鏈霉素的α-DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓,反復(fù)吹打?qū)_出的骨髓制成單細(xì)胞懸液,離心棄上清,接種于培養(yǎng)瓶中。2天后進(jìn)行首次換液,清除非貼壁細(xì)胞,以后每3天全量更換新鮮培養(yǎng)基。1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選取3-5代MSCs使用。2.MSCs鑒定通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記,鑒定所取細(xì)胞。具體過(guò)程如下:細(xì)胞傳至4代時(shí),選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞,0.25%胰酶消化,4℃離心,1200 r/min,5min,用PBS清洗細(xì)胞3次,各管依次加入單克隆抗體CD34、CD44、CD45、CD90。同時(shí)每管樣品設(shè)立未加抗體的陰性對(duì)照。避光冰上孵30min,用PBS洗滌細(xì)胞3次,以除去未結(jié)合抗體,用500 μLPBS重懸細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。3.慢病毒轉(zhuǎn)染自身失活慢病毒表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(GFP)基因的β控制下的巨細(xì)胞病毒(CMV)肌動(dòng)蛋白/β 珠蛋白基因內(nèi)含子的雜合啟動(dòng)子(LV-GFP)應(yīng)用(19)。MSCs以5× 104個(gè)/孔的密度接種在六孔板上,在37℃的環(huán)境下培養(yǎng)24h,感染復(fù)數(shù)(MOI)為50。后除去含病毒的培養(yǎng)基,將MSCs培養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上48小時(shí)。含GFP標(biāo)記的MSCs通過(guò)流式細(xì)胞儀分選。4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及模型制備根據(jù)隨機(jī)數(shù)字分組法將48只大鼠分成WB(weight bearig)組,IM-MSCs(immobilized and MSCs received)組,IM-PBS(immobilized and PBS received)組。IM-MSCs和IM-PBS組大鼠右F肢采用石膏固定法制動(dòng)14天,WB組未制動(dòng),下肢捆綁同重量石膏,但未限制關(guān)節(jié)活動(dòng),1M天后各組大鼠解除右后肢石膏固定,取標(biāo)本分析。模型制備過(guò)程如下:大鼠行8%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后,在其右側(cè)后肢的踝關(guān)節(jié)及腹股溝等血管容易受壓處襯一層薄厚適宜的棉墊,為保證負(fù)重等量可塑性石膏,將石膏繃帶裁剪成1.5cm寬,20-25cm長(zhǎng),固定大鼠右下肢:足趾屈120°,膝關(guān)節(jié)伸直[10],使比且魚(yú)肌處于縮短位。5.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植造模成功后24小時(shí),IM-MSCs組及IM-PBS組所有大鼠麻醉后去除可塑性石膏。IM-MSCs組大鼠比目魚(yú)肌局部多點(diǎn)注射LV-GFP-MSCs;WB組和IM-PBS組大鼠比目魚(yú)肌注射等量PBS。具體操作過(guò)程如下:消化已經(jīng)準(zhǔn)備好的4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并計(jì)數(shù),將每1×106個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞重懸于50 ul無(wú)菌生理鹽水中,IM-MSCs組大鼠右側(cè)比目魚(yú)肌肌腹多點(diǎn)注射50 ul間充質(zhì)干細(xì)胞懸液,WB組和IM-PBS組大鼠于相同位置注入等體積的PBS。注射完成后再次可塑性石膏制動(dòng),2周后去除可塑性石膏,取材分析。6.肌肉組織學(xué)及肌肉力量檢測(cè)各組大鼠固定14天,8%水合氯醛行腹腔內(nèi)注射麻醉后,仔細(xì)解剖出比目魚(yú)肌,用不可吸收的手術(shù)線(xiàn)將兩端綁牢。將肌肉放入22℃-24℃的林格氏液中,使肌肉處于松弛狀態(tài),一端以手術(shù)線(xiàn)固定在實(shí)驗(yàn)架上,并將電極深埋在結(jié)扎附著點(diǎn)附近,另外一端以手術(shù)線(xiàn)為牽引,連接于肌肉張力換能器的傳感器上,并連接計(jì)算機(jī)。調(diào)節(jié)強(qiáng)直刺激電流強(qiáng)度100Hz,時(shí)間400ms,采集數(shù)據(jù)并分析。其余肌肉組織用常規(guī)甲醛固定后經(jīng)過(guò)夜脫水,橫向切成約3 um厚的組織切片。切片行HE染色切片后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行評(píng)估,并用數(shù)碼相機(jī)拍攝的照片。7.Bromodeoxyuridine(Brdu)的標(biāo)記與測(cè)量24h后各組大鼠連續(xù)腹腔注射BrdU(0.8 mg/ml)3天,14d后取比目魚(yú)肌分析。樣品洗凈后切片,與小鼠抗BrdU單克隆抗體孵育(1:200,sigma,美國(guó))和Pax7抗體(1:200,Abcam)4℃過(guò)夜。隨后孵育 Alexa 594 山羊抗小鼠 IgG(1:500,Abcam)和Alexa 488羊抗兔IgG(1:500、Abcam)二抗。滴適量DAPI于標(biāo)本上用于染核,放置lmin。被FITC標(biāo)記的小鼠抗BrdU單克隆抗體顯示綠色熒光,而Pax7抗體顯示紅光。后放置在熒光顯微鏡下數(shù)取Pax7/BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。技術(shù)方法:通過(guò)Image-pro plus 5.0軟件及其配套的系統(tǒng)完成圖像采集及計(jì)數(shù),每組大鼠取25張切片計(jì)數(shù),從而得出Pax7/BrdU陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)量。8..脫氧核苷末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)肌細(xì)胞凋亡肌細(xì)胞的凋亡采用TUNEL法檢測(cè),試劑盒來(lái)自美國(guó)Roche公司,實(shí)驗(yàn)步驟遵循說(shuō)明書(shū):肌肉組織切成6微米厚度的切片(已被多聚賴(lài)氨酸處理)20分鐘,后在TUNEL反應(yīng)混合物中避光孵育60分鐘,溫度37℃。DAPI染核,在顯微鏡下觀(guān)察觀(guān)察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),Image J軟件分析。9.蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting,WB)肌肉勻漿混合在溶解緩沖液和蛋白酶抑制劑中,煮沸,經(jīng)SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上,5%奶粉封閉,Phospho-AktSer473(1:1,000,#9271,Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA),Akt(1:1,000,#9272 Cell Signaling Technology),Bcl-2(1:1,000,G9545,Sigma-Aldrich),Bax(1:1,000,B3428,Sigma-Aldrich)等一抗4℃孵育過(guò)夜,相對(duì)應(yīng)的二抗孵育,生物成像系統(tǒng)成像,條帶通過(guò)Image J軟件分析。10.統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism軟件分析處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示。采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P0.05為差異有顯著性意義,P0.01為差異有非常顯著性意義。研究結(jié)果1.MSCs培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定原代培養(yǎng)24 h后有少量細(xì)胞貼壁,漂浮細(xì)胞較多,大多為血細(xì)胞。2d后首次換液,可見(jiàn)散在的貼壁細(xì)胞,呈短梭形、橢圓形、三角形等。以后每隔3 d換液。3～7d后貼壁細(xì)胞增多,逐漸伸展呈多角形、長(zhǎng)梭形。隨著培養(yǎng)、換液的進(jìn)行,血細(xì)胞等非貼壁細(xì)胞基本去除,細(xì)胞形成集落單位。7～12 d細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底80%～90%。以1:3傳代,以后5～6 d傳代1次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第4代BMSCs表面標(biāo)記,CD44,CD90表達(dá)陽(yáng)性,CD34,CD45表達(dá)近乎陰性,CD44和CD90的陽(yáng)性率分別為93.83%,96.88%;而 CD34 和 CD45 的陽(yáng)性率分別為 6.32%,8.32%。2.肌肉濕重、肌橫截面積、最大肌收縮力結(jié)果14d后各組大鼠體重比較,無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠麻醉后獲取比目魚(yú)肌標(biāo)本,比較肌肉濕重、肌橫截面積、最大肌收縮力等指標(biāo)。與WB組比較,IM-MSCs組,IM-PBS組比目魚(yú)肌橫截面積、最大肌收縮力、濕重、肌濕重/體重?cái)?shù)值明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。但I(xiàn)M-MSCs、IM-PBS組間比較,差異無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.MSCs促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖Pax7通常作為肌衛(wèi)星細(xì)胞的特異性標(biāo)志物,而B(niǎo)rdU標(biāo)記法可以顯示新生增殖細(xì)胞。我們通過(guò)熒光染色雙標(biāo)Pax7陽(yáng)性細(xì)胞核及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞,測(cè)定肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示大鼠下肢制動(dòng)14d后,與WB組比較,IM-PBS組中Pax7+、Pax7+/BrdU+細(xì)胞下降明顯,而IM-MSCs組中Pax7+、Pax7+/BrdU+細(xì)胞明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。為有效的比較各組肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖情況,我們還比較了 Pax7+/BrdU+雙陽(yáng)性細(xì)胞占Pax7+陽(yáng)性細(xì)胞比值。與IM-PBS組比較,WB組、IM-MSCs組中Pax7+/BrdU+雙陽(yáng)性細(xì)胞占Pax7+細(xì)胞比率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明MSCs不僅阻止了肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的下降,也引起明顯的衛(wèi)星細(xì)胞增殖。4.MSCs抑制肌細(xì)胞凋亡TUNEL檢測(cè)法又稱(chēng)DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法,是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。實(shí)驗(yàn)中,綠色熒光代表斷裂或凋亡的DNA,藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核,我們每組標(biāo)本隨機(jī)選取1000個(gè)肌細(xì)胞,計(jì)算其中熒光雙標(biāo)染色數(shù)目。與WB組比較,IM-PBS組、IM-MSCs組熒光雙標(biāo)染色數(shù)目明顯增加,顯示肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而IM-PBS組、IM-MSCs組相比較,IM-MSCs組熒光雙標(biāo)染色數(shù)目明顯少于PBS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.MSCs提高Akt磷酸化水平,調(diào)控了 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá):與WB組比較,IM-MSCs組和IM-PBS組比目魚(yú)肌中Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與IM-PBS組比較,IM-MSCs組比目魚(yú)肌中Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著增高,差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。凋亡蛋白Bax的表達(dá):與WB組比較,IM-MSCs組和IM-PBS組比目魚(yú)肌中Bax蛋白表達(dá)量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與IM-PBS組比較,IM-MSCs組中Bax蛋白的表達(dá)明顯降低,差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。p-Akt/t-Akt比值結(jié)果:與WB組比較,IM-MSCs組和IM-PBS組比目魚(yú)肌中蛋白p-Akt/t-Akt比值明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與IM-PBS組比較,IM-MSCs組比目魚(yú)肌中p-Akt/t-Akt比值顯著增高,差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論在制動(dòng)所導(dǎo)致廢用性肌萎縮模型中,局部注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,抑制肌細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R746.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1629433