本文選題：脊髓壓迫性損傷　切入點：p53　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景脊髓壓迫性損傷(Compressed spinal cord injury,CSCI)是一組具有占位性特征的椎管內(nèi)病變,通常由黃韌帶硬化、椎骨骨折、髓內(nèi)腫瘤等造成,是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾患。其臨床表現(xiàn)為脊髓受壓平面以下的運動、感覺、反射及括約肌功能部分或全部障礙。如果沒有解除壓迫,及時治療,將會發(fā)生不可逆的功能喪失,給患者的身體和心理帶來嚴(yán)重傷害,進(jìn)而對患者的家庭和社會帶來極大的負(fù)擔(dān)。髓鞘在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是由少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendrocytes,OLs)形成的,它是包繞在神經(jīng)元軸突外面的一層髓磷脂膜結(jié)構(gòu)。髓鞘在神經(jīng)系統(tǒng)中起到對軸突及周圍組織的支持作用;并以 跳躍式傳導(dǎo)”確保動作電位準(zhǔn)確、快速的傳遞以及在軸突受損時引導(dǎo)軸突再生。有研究發(fā)現(xiàn),OLs的凋亡和脫髓鞘是CSCI最顯著的病理改變。髓鞘結(jié)構(gòu)的完整確保了動作電位的“跳躍式傳導(dǎo)”,所以髓鞘一旦脫失,神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)必然會受到阻滯或泛化,進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能,極大地降低患者的生活質(zhì)量。因此,如何減少OLs的損傷,避免髓鞘的脫失,是脊髓損傷修復(fù)研究的重點領(lǐng)域之一。然而,目前有關(guān)CSCI脫髓鞘的機(jī)制尚未完全闡明,因此,進(jìn)一步探討其發(fā)病機(jī)理,尋求一種有效的防止髓鞘脫失、恢復(fù)神經(jīng)沖動正常傳導(dǎo)的治療方法是當(dāng)前一個亟待解決的問題。為此,本實驗擬在制作CSCI動物及細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,采用透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM),免疫熒光染色,蛋白質(zhì)印跡(western blot),流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)等實驗方法,重點對p53在CSCI脫髓鞘病變中的作用及其機(jī)制著手進(jìn)行研究,進(jìn)一步闡明CSCI脫髓鞘病變的分子機(jī)制,為臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。目的1.制作模型探討p53是否在CSCI脫髓鞘病變中發(fā)揮作用。2.用p53特異性抑制劑PFT-μ,對CSCI模型動物及OLs體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù),觀察干預(yù)前后有髓神經(jīng)纖維髓鞘/OLs的變化,研究OLs凋亡與CSCI脫髓鞘病變之間的關(guān)系,進(jìn)一步闡明p53在脫髓鞘病變中的作用及其機(jī)制。方法1.健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠63只,隨機(jī)分為正常組(n=7)、假手術(shù)組(n=7)和CSCI組。CSCI組又進(jìn)一步分為CSCI 1h組(n=7)、CSCI 3h組(n=7)、CSCI 12h組(n=7)、CSCI 1d組(n=7)、CSCI 3d組(n=7)、CSCI 7d組(n=7)及CSCI14d組(n=7)。正常組給予常規(guī)飲食,不做任何干預(yù);假手術(shù)組僅切開椎板,不進(jìn)行壓迫;CSCI組則在行椎板切除術(shù)后采用本課題組自行研制的壓迫器壓迫脊髓2h后減壓。BBB(Basso,Beattie,and Bresnahan)運動功能評分檢測損傷后1d、3d、7d、14d大鼠后肢的運動功能;鋨酸染色及TEM觀察CSCI后不同時間點大鼠有髓神經(jīng)纖維形態(tài)學(xué)改變及數(shù)量上的變化;western blot檢測CSCI后1h、3h、12h、1d、3d、7d及14d髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP),p53,E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的表達(dá)變化;免疫熒光三標(biāo)檢測p53,E2F1,active caspase-3的共表達(dá)及caspase-12、cytochrome C與OLs表面標(biāo)記物—環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(Cyclic neucleotide phosphodiesterase,CNPase)的共表達(dá)。2.取SD乳鼠皮質(zhì),采用B104條件培養(yǎng)基(the conditioned medium prepared from B104 neuroblastoma cells,B104CM)增殖培養(yǎng)結(jié)合EDTA消化機(jī)械吹打分離純化法培養(yǎng)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)。對純化后的OPCs更換分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3d,使OPCs向OLs方向分化。3.通過氧糖剝奪建立CSCI細(xì)胞模型,然后將OLs分為3組:正常組、CSCI細(xì)胞模型組、PFT-μ組。FCM檢測各組細(xì)胞的凋亡及線粒體膜電位的變化。western blot檢測各組細(xì)胞E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的表達(dá)變化;免疫熒光檢測active caspase-3在CNPase細(xì)胞中的表達(dá)及caspase-12、cytochrome C在CNPase細(xì)胞的共表達(dá)。4.進(jìn)一步在動物模型上證實細(xì)胞實驗所得出的結(jié)論。將45只雌性SD大鼠分為假手術(shù)組(n=15)、PFT-μ組(n=15)及對照組(n=15)。BBB評分檢測CSCI后1d、3d、7d、14d各組大鼠后肢的運動功能;鋨酸染色和TEM觀察CSCI 7d時各組大鼠有髓神經(jīng)纖維數(shù)量及結(jié)構(gòu)的變化;western blot檢測損傷7d后各組大鼠MBP,E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的表達(dá)變化;免疫熒光染色檢測各組大鼠E2F1,active caspase-3的共表達(dá)及caspase-12、cytochrome C與CNPase的共表達(dá)。5.用SPSS軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行處理及統(tǒng)計分析。結(jié)果1.正常組和假手術(shù)組的SD大鼠BBB評分均為21分,而CSCI組大鼠的BBB評分隨著壓迫損傷后時間的延長而降低,與正常組和假手術(shù)組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。鋨酸染色和TEM結(jié)果顯示:在正常組和假手術(shù)組,有髓神經(jīng)纖維在白質(zhì)中均勻分布;而在CSCI組,隨著壓迫損傷后時間的延長,有髓神經(jīng)纖維出現(xiàn)水腫、崩解,并且在數(shù)量上逐漸減少(P0.05)。免疫熒光染色顯示:假手術(shù)組MBP的免疫反應(yīng)性高,而損傷后7d,MBP的免疫反應(yīng)性明顯降低;p53,E2F1和active caspase-3的共表達(dá)在假手術(shù)組呈散在分布,而在CSCI后7d,共表達(dá)明顯增多;caspase-12+-cytochrome C+-CNPase細(xì)胞在假手術(shù)組幾乎沒有分布,但是在損傷后7d,caspase-12+-cytochrome C+-CNPase細(xì)胞廣泛分布于脊髓的白質(zhì)。western blot結(jié)果顯示MBP的蛋白表達(dá)量在損傷后逐漸降低(P0.05);p53,E2F1的蛋白表達(dá)水平在損傷后先增加后降低,但都高于正常組和假手術(shù)組(P0.05);active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的蛋白表達(dá)水平在損傷后逐漸增加(P0.05)。2.OPCs在B104CM增殖聯(lián)合EDTA消化機(jī)械吹打法培養(yǎng)后用OPC特異性抗體NG2檢測,純度達(dá)到95%以上。分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)后用MBP(OLs標(biāo)記物)標(biāo)記細(xì)胞,純度達(dá)90%以上。3.FCM檢測正常組、CSCI細(xì)胞模型組、PFT-μ組細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果顯示CSCI細(xì)胞模型組細(xì)胞凋亡率最高,PFT-μ組細(xì)胞次之,正常組細(xì)胞凋亡很少,兩兩相比,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。線粒體膜電位檢測顯示CSCI模型組和PFT-μ組細(xì)胞熒光強度均較正常組減弱,但細(xì)胞模型組熒光強度明顯低于PFT-μ組(P0.05)。western blot結(jié)果顯示雖然E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的蛋白表達(dá)水平在CSCI模型組、PFT-μ組均較正常組高,但是在CSCI模型組升高的更為明顯(P0.05)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)active caspase-3在CSCI模型組CNPase細(xì)胞中高表達(dá),而在PFT-μ組表達(dá)較少;caspase-12+-cytochrome C+-CNPase細(xì)胞在CSCI模型組數(shù)量較多,而在PFT-μ組呈零星分布。4.PFT-μ干預(yù)CSCI大鼠后,大鼠的BBB評分雖然較假手術(shù)組低,但明顯高于對照組(P0.05),并且有髓神經(jīng)纖維數(shù)量也較對照組增多(P0.05)。電鏡結(jié)果顯示:假手術(shù)組的髓鞘板層排列緊密,厚薄均一;對照組的神經(jīng)纖維髓鞘明顯水腫,髓鞘板層從神經(jīng)纖維周圍分離、剝脫甚至斷裂;PFT-μ組中雖然個別神經(jīng)纖維髓鞘板層仍有崩解,但大多數(shù)神經(jīng)纖維髓鞘形態(tài)趨于正常,并且水腫程度也明顯減輕。MBP蛋白表達(dá)在PFT-μ組雖然也降低,但明顯高于CSCI組(P0.05)。western blot結(jié)果顯示,雖然E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的蛋白表達(dá)水平在PFT-μ組和對照組都升高,但在PFT-μ組的升高幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組(P0.05)。E2F1和active caspase-3的共表達(dá)在PFT-μ組零散分布,而在對照組則廣泛存在。caspase-12、cytochrome C陽性的CNPase細(xì)胞在PFT-μ組及假手術(shù)組的脊髓白質(zhì)里散在分布,但是廣泛分布于對照組。結(jié)論1.大鼠CSCI后,發(fā)生脫髓鞘病變,致使大鼠的運動功能障礙。隨著損傷時間的延長,凋亡相關(guān)蛋白p53,E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的表達(dá)逐漸升高,OLs凋亡增多。2.PFT-μ干預(yù)動物及細(xì)胞CSCI模型后,凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)降低,OLs凋亡減少,脫髓鞘病變得到明顯改善。3.CSCI脫髓鞘的發(fā)生與p53的高表達(dá)有關(guān)。p53的高表達(dá)可以促進(jìn)E2F1的表達(dá),導(dǎo)致凋亡的發(fā)生;同時,p53的高表達(dá)還可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,cytochrome C介導(dǎo)的線粒體凋亡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體之間的相互作用,觸發(fā)OLs的凋亡,最終導(dǎo)致脫髓鞘的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R744.5

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本文編號：1630350