本文選題：越鞠丸　切入點(diǎn)：快速抗抑郁　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的越鞠丸是治療中醫(yī)郁證的經(jīng)典方,其治療抑郁癥作用得到眾多臨床研究結(jié)果支持。我們前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床研究發(fā)現(xiàn)越鞠丸還具有快速抗抑郁的特性,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)越鞠丸可快速提高抑郁癥相關(guān)腦區(qū)海馬腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)的表達(dá),并激活PACAP下游PKA-CREB信號(hào),且其抗抑郁作用依賴于CREB的激活。在此基礎(chǔ)上,我們提出海馬PACAP及相關(guān)信號(hào)通路作為介導(dǎo)越鞠丸快速抗抑郁的分子神經(jīng)基礎(chǔ)的假說。本項(xiàng)目擬采用電生理、免疫印跡、顱內(nèi)微注射PACAP激動(dòng)劑和拮抗劑、RNAi等技術(shù)研究越鞠丸的快速抗抑郁機(jī)制,包括:1.對(duì)海馬PACAP表達(dá)的依賴性;2.與PACAP下游PKA、CREB等通路的相關(guān)性;3.PACAP通路引起的突觸可塑性變化的相關(guān)性。本項(xiàng)目通過研究PACAP在越鞠丸快速抗抑郁中的作用機(jī)制,確立了 PACAP作為快速抗抑郁的新靶點(diǎn),并為越鞠丸臨床應(yīng)用的擴(kuò)大提供了科學(xué)依據(jù)。方法1.電生理實(shí)驗(yàn)將昆明小鼠分為3組,分別是口服純水+腹腔注射生理鹽水組、口服YJ+腹腔注射H89組、口服YJ+腹腔注射生理鹽水組。對(duì)小鼠海馬CA1區(qū)進(jìn)行連續(xù)性電刺激后,分析比較三組的快興奮性突觸后電位(f-EPSP)的斜率。為了檢測PACAP的時(shí)程變化,昆明小鼠被分為30分鐘、2小時(shí)、24小時(shí)三批進(jìn)行小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)后,各時(shí)間點(diǎn)的樣品一半用于Western Blot檢測,一半用于Real-Time PCR檢測。同樣時(shí)間點(diǎn)的三批小鼠進(jìn)行海馬cAMP水平的檢測。2.PACAP側(cè)腦室微注射實(shí)驗(yàn)將小鼠分別分為4組:a.手術(shù)+生理鹽水組b.手術(shù)+PACAP 低劑量組(18.75 pmol)c.手術(shù)+PACAP 中劑量組(75 pmol)d.手術(shù)+PACAP高劑量組(300 pmol)。4組小鼠均在處理后30分鐘開始進(jìn)行懸尾、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的測試,測試一直持續(xù)到處理后第10天。PACAP拮抗劑實(shí)驗(yàn)分為4組,分別是:海馬注射生理鹽水+ 口服生理鹽水組,海馬注射生理鹽水+ 口服YJ組,海馬注射PACAP6-38+口服生理鹽水組,海馬注射PACAP6-38+口服YJ組。4組在灌胃后30分鐘到48小時(shí)分別進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。PACAP RNAi實(shí)驗(yàn)分為4組:a.海馬注射陰參病毒+ 口服生理鹽水組,海馬注射陰參病毒+ 口服YJ組,海馬注射PACAP RNAi+口服生理鹽水組,海馬注射PACAP RNAi+口服YJ組。4組在灌胃后30分鐘到48小時(shí)分別進(jìn)行了懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及糖偏好實(shí)驗(yàn)。Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測給藥后30分鐘小鼠海馬PACAP、PKA、CREB、PSD95的蛋白表達(dá)。3.單籠喂養(yǎng)的小鼠接受3周的溫和應(yīng)激。最后一次CMS造模后單次給予越鞠丸和氯胺酮處理,處理后2小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)動(dòng)物以SPT,OPT,TST,FST和NSF的順序進(jìn)行行為學(xué)檢測。免疫印跡檢測昆明小鼠海馬的PACAP及BDNF表達(dá)。4.越鞠丸石油醚部位快速抗抑郁潛力實(shí)驗(yàn)在方法上采用在30min及24h對(duì)昆明小鼠進(jìn)行小鼠懸尾行為絕望測試,Western blot實(shí)驗(yàn)檢測小鼠海馬區(qū)BDNF及TrkB蛋白的表達(dá)。梔子有效部位實(shí)驗(yàn)首先將梔子根據(jù)極性大小分得四個(gè)部位。在梔子四個(gè)部位單次給藥后24小時(shí)使用小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)(TST)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)來篩選具有快速抗抑郁潛力的梔子下分部位。單次給藥有效的部位進(jìn)一步使用慢性應(yīng)激模型(CMS),以及包括TST,FST,蔗糖偏好測試(SPT)和新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)(NSF)在內(nèi)的一系列綜合行為測試來確認(rèn)其快速抗抑郁作用。為了測試BDNF信號(hào)與梔子有效部位快速抗抑郁作用之間的關(guān)聯(lián),我們對(duì)梔子有效部位單次給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的海馬BDNF及TrkB表達(dá)進(jìn)行了測試。梔子石油醚部位下分有效部位的快速抗抑郁研究采用給藥后24h進(jìn)行小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)來初步篩選具有快速抗抑郁潛力的梔子石油醚有效部位。給藥30min后進(jìn)行懸尾行為實(shí)驗(yàn)及給藥2h后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)以測試梔子石油醚有效部位起效時(shí)間。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測2h及24h小鼠海馬區(qū)BDNF及p-eEF2蛋白的表達(dá)。梔子環(huán)烯醚萜部位快速抗抑郁實(shí)驗(yàn)分為有效劑量初篩實(shí)驗(yàn)(初始起效時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)和藥效持續(xù)時(shí)間實(shí)驗(yàn))、慢性模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)及阻斷劑實(shí)驗(yàn)。具體采用給藥后24h進(jìn)行小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn),從高(200mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)三個(gè)劑量來初步篩選具有快速抗抑郁潛力的梔子環(huán)烯醚帖部位。給藥2小時(shí)及給藥30分鐘后進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)以測試梔子石油醚有效部位起效時(shí)間。給藥3天、5天、7天組的小鼠分別進(jìn)行新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),給藥10天及14天的小鼠進(jìn)行新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)。給予慢性溫和刺激造模組小鼠中劑量梔子環(huán)烯醚帖24小時(shí)后依次進(jìn)行開場實(shí)驗(yàn)、糖偏好測試、新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),給藥3天、5天、7天組的小鼠分別進(jìn)行新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),給藥10天及14天的小鼠進(jìn)行新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測30分鐘、2小時(shí)及24小時(shí)小鼠海馬區(qū)BDNF的表達(dá)。2小時(shí)及24小時(shí)小鼠海馬區(qū)PKA、p-CREB及CREB的表達(dá)。測試組小鼠腹腔注射PKA阻斷劑H89后給予梔子環(huán)烯醚帖,分別于給藥后30分鐘、2小時(shí)、24小時(shí)進(jìn)行小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)。結(jié)果1.電生理結(jié)果顯示,與口服純水+腹腔生理鹽水給藥組相比,口服YJ+腹腔生理鹽水組長時(shí)稱增強(qiáng)作用顯著的增強(qiáng)。與口服YJ+腹腔生理鹽水組相比,口服YJ+腹腔H89組的長時(shí)稱增強(qiáng)作用顯著降低。與空白組相比,給藥30min、2h、24h后越鞠丸組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間顯著降低。與空白組相比,給藥30min后越鞠丸組小鼠海馬PACAP蛋白水平及mRNA表達(dá)均顯著上調(diào),給藥2h后越鞠丸組小鼠海馬PACAP蛋白水平及mRNA表達(dá)無顯著變化,給藥24h后越鞠丸組小鼠海馬PACAP蛋白水平及mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。越鞠丸給藥30分鐘組、給藥2小時(shí)組與給藥24小時(shí)組的小鼠海馬cAMP水平均無明顯變化。2.側(cè)腦室PACAP給藥在TST,FST和NSF上顯示出抗抑郁樣作用。雙側(cè)海馬注射PACAP拮抗劑或PACAP RNAi能夠逆轉(zhuǎn)越鞠丸在TST,FST和NSF上的快速抗抑郁作用。其中,雙側(cè)海馬PACAP RNAi處理后小鼠海馬出現(xiàn)PACAP,PKA,CREB,PSD95蛋白的下調(diào)。單次越鞠丸處理能夠逆轉(zhuǎn)這種分子變化。3.三周造模后,造模組小鼠出現(xiàn)了一系列抑郁樣行為(包括體重、糖偏好和單位攝食量的降低以及攝食潛伏期和懸尾游泳不動(dòng)時(shí)間的延長)。越鞠丸單次給藥2h、24h、48h均能顯著逆轉(zhuǎn)模型造成的小鼠抑郁樣行為。給藥后2小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí),與空白組相比,模型組小鼠海馬的PACAP、BDNF表達(dá)顯著降低,與模型組相比,模型+YJ組小鼠海馬的PACAP、BDNF表達(dá)顯著上調(diào)。4.越鞠丸石油醚部位單次給藥后從30分鐘到24小時(shí)均能對(duì)其小鼠懸尾的行為絕望行為產(chǎn)生抗抑郁作用。給予越鞠丸石油醚部位30分鐘后小鼠海馬中的BDNF及其受體TrkB的表達(dá)顯著上調(diào),且這種抗抑郁的作用機(jī)制可持續(xù)到給藥后24小時(shí)。梔子的石油醚部位和正丁醇部位在急性給藥后的FST實(shí)驗(yàn)中顯示出快速抗抑郁的潛力。在急性給藥后的TST實(shí)驗(yàn)中,GJ-PE的抗抑郁作用時(shí)間比GJ-BO更長。在慢性應(yīng)激模型上,GJ-PE或GJ-BO單次給藥顯著逆轉(zhuǎn)了模型小鼠在TST、FST、SPT或NSF行為上的抑郁樣行為,從而證實(shí)了梔子兩個(gè)部位具有快速抗抑郁作用。分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GJ-PE單次給藥后增加了海馬BDNF和TrkB蛋白的表達(dá),而GJ-BO處理并未發(fā)現(xiàn)這樣的影響。單次給藥GJ-PE1后2小時(shí)到24小時(shí)均能降低小鼠強(qiáng)迫游泳行為的不動(dòng)時(shí)間,同時(shí)降低小鼠陌生環(huán)境下攝食的潛伏時(shí)間。GJ-PE3單次給藥24小時(shí)后能降低小鼠陌生環(huán)境下攝食的潛伏時(shí)間。GJ-PE4給藥24小時(shí)后能增加小鼠陌生環(huán)境下的攝食量。給藥2小時(shí)后,GJ-PE1小鼠海馬中的BDNF表達(dá)顯著上調(diào),而p-eEF2表達(dá)顯著下調(diào),24小時(shí)后小鼠海馬中BDNF表達(dá)顯著下調(diào)而p-eEF2表達(dá)顯著上調(diào)。中劑量梔子環(huán)烯醚帖在給藥30分鐘后顯著降低了小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間,其抗抑郁作用能夠在小鼠懸尾、強(qiáng)迫游泳模型上持續(xù)到第7天,在新奇抑制攝食模型條件下能夠持續(xù)到至少第14天。與越鞠丸類似,在慢性不可預(yù)知的溫和刺激模型中,環(huán)烯醚萜單次給藥24小時(shí)后,逆轉(zhuǎn)了造模動(dòng)物糖偏好的降低,懸尾及強(qiáng)迫游泳測試中不動(dòng)時(shí)間的延長,以及新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)中單位攝食量的降低和攝食潛伏時(shí)間的延長等抑郁-焦慮樣行為。其在慢性模型上單次給藥的的抗抑郁作用同樣能夠持續(xù)至少14天。分子研究結(jié)果提示梔子環(huán)烯醚萜單次給藥24小時(shí)后海馬PKA-CREB信號(hào)通路的激活,而該時(shí)間點(diǎn)的抗抑郁作用不依賴于BDNF的激活;對(duì)PKA-CREB信號(hào)通路的阻斷逆轉(zhuǎn)了其24小時(shí)的抗抑郁效應(yīng)。結(jié)論1.越鞠丸急性給藥24小時(shí)后抗抑郁作用的特異性腦區(qū)之一為海馬CA1區(qū)。越鞠丸給藥后昆明小鼠海馬中PACAP蛋白及mRNA表達(dá)即刻而非持續(xù)的增加與其快速抗抑郁作用相關(guān)。越鞠丸給藥后30分鐘到24小時(shí),小鼠海馬中的cAMP表達(dá)無影響。2.昆明小鼠側(cè)腦室內(nèi)高中低劑量的PACAP注射均能產(chǎn)生抗抑郁樣作用,其抗抑郁效應(yīng)至少可以持續(xù)到注射后第10天。雙側(cè)海馬PACAP拮抗劑及PACAP RNAi處理阻斷了越鞠丸的快速抗抑郁作用。PACAP,PKA,CREB,PSD95蛋白的顯著下調(diào)與抑郁樣行為的發(fā)生相關(guān)。越鞠丸給藥后30分鐘的快速抗抑郁作用與PACAP、PKA、CREB、PSD95蛋白的激活相關(guān)。3.小鼠海馬區(qū)PACAP、BDNF下調(diào)與抑郁癥的發(fā)病相關(guān),單次越鞠丸給藥能夠逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激病理模型造成的小鼠海馬區(qū)PACAP、BDNF表達(dá)的下調(diào)。4.越鞠丸石油醚部位具有快速抗抑郁的藥物潛力且這種潛在的快速抗抑郁作用與BDNF及其受體TrkB的激活相關(guān)。梔子的兩個(gè)部位GJ-PE和GJ-BO在急性給藥和CMS模型上表現(xiàn)出快速抗抑郁作用。然而,僅僅GJ-PE作用與小鼠海馬BDNF信號(hào)通路的激活相關(guān)。梔子石油醚的4個(gè)下分部位中,GJ-PE1最具有快速抗抑郁潛力,起效時(shí)間為給藥后2小時(shí),其機(jī)制與BDNF的上調(diào)及p-eEF2的下調(diào)相關(guān)。GJ-PE3、GJ-PE4具有部分潛在快速起效抗抑郁藥物的特征。GJ-PE2不具有快速抗抑郁作用。梔子環(huán)烯醚萜部位可能為梔子和越鞠丸快速持久抗抑郁效應(yīng)中的關(guān)鍵藥物部位。與越鞠丸類似,該部位的快速持久抗抑郁作用依賴于PKA-CREB信號(hào)通路的激活。與越鞠丸不同的是,該部位早期抗抑郁作用不依賴于BDNF快速表達(dá)的升高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 許二平;苗明三;尚立芝;;基于抑郁癥細(xì)胞因子、神經(jīng)-內(nèi)分泌發(fā)病機(jī)制的中醫(yī)藥治療新進(jìn)展[J];河南中醫(yī);2017年02期

2 任荔;吳顥昕;陳剛;;越鞠丸抗抑郁研究進(jìn)展[J];中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志;2016年10期

3 任荔;陶偉偉;柴毅;李守雪;王省;張煜萱;陳麗;夏寶妹;吳顥昕;陳剛;;梔子石油醚有效部位的快速抗抑郁潛力與BDNF、p-eEF2的表達(dá)上調(diào)相關(guān)[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2016年09期

4 梁芯;唐靜;張楊;陳林木;王飛飛;譚川雪;蔣林;黃春霞;高原;羅艷敏;肖倩;晁鳳蕾;綦英強(qiáng);朱殷青;唐勇;;抑郁癥CUS模型大鼠海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)內(nèi)樹突棘數(shù)目減少[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2016年01期

5 任荔;陶偉偉;薛文達(dá);吳顥昕;陳剛;;越鞠丸石油醚部位潛在的快速抗抑郁作用與BDNF、TrkB蛋白表達(dá)的上調(diào)相關(guān)[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2015年12期

6 周麗;賀龍剛;;“火郁發(fā)之”理論源流及臨床價(jià)值[J];遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2015年05期

7 陳明鑒;姚冉;;越鞠丸聯(lián)合度洛西汀治療伴有軀體焦慮抑郁癥的臨床觀察[J];神經(jīng)損傷與功能重建;2015年02期

8 周紅香;廖維政;王滿英;劉璐;李玉香;康麗蘭;;越鞠丸合甘麥大棗湯加減治療產(chǎn)后抑郁癥[J];中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新;2015年06期

9 石文靜;周步天;張海樓;陳剛;;越鞠丸中不同工藝的梔子醇提物對(duì)小鼠的抗抑郁作用[J];實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志;2014年16期

10 孫占衛(wèi);;越鞠丸治療中風(fēng)后抑郁隨機(jī)平行對(duì)照研究[J];實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志;2014年02期

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本文編號(hào)：1608904